干性的研究.docVIP

附件2 论文中英文摘要 作者姓名：于风燕 论文题目：Let-7 microRNA 调控乳腺癌干细胞“干性”的研究 作者简介：于风燕，女，1978年3月出生。2003年获得硕士研究生免试资格就读中山大学，2005年9月免试转为硕博连读生，师从于中山大学宋尔卫教授，于2008年6月获得博士学位。 中 文 摘 要 研究背景 越来越多的研究证明，实体恶性肿瘤内存在一小部分成瘤能力强，分化程度低的细胞，称为“肿瘤启动细胞（tumor initiating cells）”，“成瘤性癌细胞（tumorigenic cells）”或“癌干细胞（cancer stem cells）”。癌干细胞具有类似于成体干细胞的特性： 自我更新的能力、多向分化的潜能，以及强大的体内成瘤能力。尽管在癌组织中癌干细胞的数目极少，但是癌干细胞在肿瘤的发生、发展和转移中却发挥了至关重要的作用，而且是肿瘤逃避常规治疗导致最终复发的罪魁祸首。因此，消灭癌干细胞才是肿瘤治疗的关键。 近年关于microRNA（miRNA）对基因表达调控的研究发现，这些微小分子RNA所调控的目标基因主要是与细胞分化、增殖、细胞周期和凋亡调控，以及机体发育相关的基因。多种miRNA分子通过沉默癌基因或者抑癌基因的表达，参与癌细胞重要细胞生物程序的调控。此外，miRNA还调控胚胎干细胞或成体干细胞的分化和发育。虽然miRNA是调节基因表达的重要机制，但是这些非编码小分子RNA是否也影响着癌干细胞的命运目前还不清楚。 研究目标 建立富集乳腺癌干细胞的方法，解决癌干细胞研究中由于癌干细胞数量极少所致的瓶颈问题。 检测乳腺癌干细胞与非癌干细胞之间是否存在miRNA表达的变化，探讨miRNA是否调控着不同亚群的肿瘤细胞之间的演变转化，是否调控癌干细胞的“干性（stemness）”。 研制特异性靶向乳腺癌干细胞的载体，导入miRNA抑制乳腺癌干细胞自我增殖和体内成瘤，并逆转乳腺癌干细胞的化疗耐药性。探讨特异靶向乳腺癌干细胞的治疗方法。 研究方法 围绕上述目标，本研究采用以下研究方法：1. 乳腺癌干细胞的富集和分离鉴定：将SKBR3细胞株种植于免疫缺陷的NOD/SCID 鼠，形成的异种移植瘤体内连续传代，同时给予低剂量化疗压力富集乳腺癌干细胞。通过球囊形成能力评价癌干细胞的体外自我更新能力；通过免疫细胞化学及流式细胞分析的方法检测乳腺癌分化标志物CK14、CK18、MUC-1、α-SMA的表达，以评价癌干细胞的分化潜能；使用3H-胸腺嘧啶掺入法检测癌干细胞的增殖能力；使用连续异种移植瘤形成实验评价成瘤能力。另一方面，对于原代乳腺癌细胞，使用流式细胞分选仪分选出lin-CD44+CD24-的乳腺癌干细胞。2. 乳腺癌干细胞miRNA表达与功能研究：乳腺癌干细胞和非癌干细胞之间miRNA表达的差异通过miRNA 微阵列的方法来比较，使用qRT-PCR和Northern Blot来验证let-7等miRNA表达的差异；使用荧光素酶报告系统来评价let-7 miRNA的功能。用慢病毒载体转导let-7a或H-RAS shRNA或HMGA2 shRNA，或者使用寡核苷酸（ASO）阻断let-7的表达等方法来验证let-7功能和表达的意义，用qRT-PCR 和western blot分别检测let-7 的靶基因H-RAS和HMGA2的mRNA表达和蛋白表达。 3. 靶向乳腺癌干细胞导入miRNA的研究：使用hyluronin包被修饰的脂质体载体（HA-LIP）将let-7a或H-RAS siRNA或HMGA2 siRNA特异性导入CD44+的乳腺癌干细胞；使用流式细胞仪和荧光显微镜分析转染效率和分布。使用MTT、Annexin Ⅴ/PI、Tunnel检测化疗敏感性；使用western blot检测ABCG2的表达，使用流式细胞仪检测侧群细胞（side population，SP）的比例。 研究结果 在原发性乳腺癌患者肿瘤组织中，接受新辅助化疗的乳腺癌患者比未接受化疗的患者相比含有较多的CD44+CD24-的具有自我更新能力的乳腺癌细胞；同一患者化疗后比化疗前乳腺癌干细胞比例增加；复发的乳腺癌患者恶性胸水中富含有CD44+CD24-的乳腺癌干细胞。我们将SKBR3乳腺癌细胞株种植于免疫缺陷的NOD/SCID 鼠乳腺脂肪垫，形成的异种移植瘤后在体内连续传代3次，同时给予低剂量化疗压力，所获得的第三代细胞（SK-3rd细胞）的球囊形成能力远远高于源细胞SKBR3，SK-3rd球囊细胞具有癌干细胞的表型，不表达上皮型和间叶型癌细胞的分化标志物，体内成瘤能力高于SKBR3细胞，更容易发生肺转移和肝转移。 MiRNA微阵列分析的结果显示SK-3rd球囊细胞中50多种miRNA的表达降低，其中let-7家族成员在癌干细胞