HIF干扰表达载体psilencer3.0-HIF—α siRNA的构建和鉴定.pdfVIP

维普资讯 维普资讯 《中国癌症杂志》2007年第17卷第12期 购 自Takara公司；TaqDNA聚合酶购 自Promega公 成 氯化钙法制备 DH5ot大肠杆菌感受态细胞，冻 司；PfuDNA聚合酶购 自上海生物工程公司；T4连 存于-70oC备用。扩增和纯化质粒psilencer3．0一H1。 接酶购 自华美生物工程公司；小量质粒抽提试剂盒 根据 Genbank 中报道 的 HIF一1Ot(NM001530)和 购 自上海申能博采公司；大量质粒抽提试剂盒购 自 HIF-2ot(NM001430)基因核苷酸序列，参考 siRNA Qiagen公司；低分子量标准蛋 白质购 自华美公司； 设计原则进行设计，最后各选择 出4条片段作为 DNAMarker、琼脂糖购 自GibcoBRL公司；蛋 白 HIF．1Ot和HIF-2ot基因干扰片段 (见表 1)。每对寡 Marker购 自Bio—rad公司；Lipofectamine脂质体购 自 核苷酸两端分别带有 BamHI和Hind111酶切位点， Invitrogen公司。 送北京赛百盛生物试剂公司合成。 1．2 HIF-let和 IⅢ ．-2 基因干扰片段的设计与合 表 1 H -let和HIF-2et基因干扰片段 Tab．1 InterferencefragmentofHIF-letandHIF-2a 1．3 psilencer3．0-siRNA 表达载体的构建 先将 h等)。同时转染空 白质粒 psilencer3．0一H1作为对 互补的两条片段进行退火处理，然后将退火的双链 照。 片段与经BamHI和Hind111双酶切后的载体按摩尔 1．6 RealTime-PCR检测 HIF-lot和 HⅡ-2 mR- 比3：1的比例进行连接反应，同时设立阴性对照和 NA表达水平 取转染后不同时间点的肿瘤细胞 5 质粒 psilencer3．0一H1的阳性对照反应，置 l6℃过 ×10，加入 lmlTrizol试剂，充分匀浆后按说明书步 夜。将连接产物各取4 1分别接种于 100 l的 骤提取总RNA。每组取 1 g总RNA模板建立2O DH5ot感受态细胞中进行转化。挑取单菌落扩增培 l逆转录反应体系，42℃反应 60min，99oC灭活 5 养，质粒小量抽提。用限制性内切酶 Bgl11分别对 min。每组各取 1 lcDNA模板分别进行 PCR扩 重组质粒进行单酶切 (此位点为 目的序列所特有的 增。HIF一1Ot引物序列：Fw 5’一GCAAGACTITCCT— 酶切位点)鉴定。 CAGTCGACACA一3’．RV5’一GCATCCTGTACTGTCCT． 1．4 测序鉴定 将鉴定证实后的编码 HIF一1Ot和 GTGGTGA一3’，产物大小为 110bp；HIF2·or引物序 HIF-2ctsiRNA共8个重组质粒送大连宝生物工程有 列 ：Fw 5’一GAGCAGCTCGGAGCTGAGG一3’，RV5’一 限公司测序酶切。 CCTCAGCTCCGAGCTGCTC一3’。产物大小为 110bp； 1．5 细胞培养与转染 人肾癌细胞 786-0和 OS— p—actin 弓I物 序 歹0：FW5’一GGACCTGACCTGC— RC-2在含 10％胎牛血清的DMEM培养基中进行常 CGTCTAG一3’．RV 5’一TAGCCCAGGATGCCCTrGAG一 规培养和传代。质粒转染采用 Lipofectamine2000。 3’，产物大小为98bp。实时荧光定量 PCR反应体 将4 g重组质粒和 1O lLipofectamine2000分别用 系为2O l，反应条件 ：95℃变性 3min；(95℃变