花药特异性表达类查尔酮合酶基因D5与水稻花粉发育相关.pdfVIP

第45 卷 第 11 期 2000 年6 月 论 文 花药特异性表达的类查尔酮合酶基因D5 与水稻花粉发育相关 * 郑宏红 瞿礼嘉 刘美华 张 毅 申云平 魏军明 * 潘乃 顾红雅 陈章良 (北京大学蛋白质工程及植物基因工程国家重点实验室, 北京 100871. * 联系人, Email: guhy@plum.lsc.pku.edu.cn) 摘要 采用RNA 原位杂交技术对水稻类查尔酮合酶基因D5 进行细胞定位 结果表明D5 基因 特异地在水稻花药的绒毡层及维管束周围细胞中大量表达. 为了进一步研究其功能, 将水稻肌动 蛋白基因(Actin 1)启动子驱动的D5 正义及反义基因分别转入水稻中. 对转基因水稻花粉不同发育 时期进行观察, 发现表达了反义D5 基因的花粉其形态表现明显不正常, 由此可以推测出D5 基因 对于花粉的发育起重要作用. 关键词 反义 花粉发育 水稻 原位杂交 在高等植物中, 花粉的发育是一个十分复杂的过程. 首先, 小孢子母细胞经减数分裂形 成四分体, 然后形成单核小孢子 双核和/或三核小孢子, 同时伴随着花粉壁的形成. 在这一 [1] 过程中, 绒毡层细胞起到了很重要的作用, 为小孢子及花粉的发育提供营养物质 . 人们已经 [2] [3] [4] 从油菜 番茄 水稻 等植物中分离得到了很多在花药发育过程中特异表达的基因, 原位 [4, 5] 杂交的结果表明其中的一些基因是在绒毡层特异表达的 . 但是, 除了少数基因, 如番茄中 的LAT52 [3], 多数基因的功能尚不清楚. 在本实验室前期的研究中, 分离得到了在水稻花药中特异表达的类查尔酮合酶(chalcone sythase-like, CHS-like)基因D5 [6]. 进一步研究表明D5 基因在减数分裂前起始转录, 至四分体 [7] 时期达到最高峰并持续到单核小孢子时期 . 而在成熟花粉粒时期则检测不到该基因的转录. 这种表达模式与绒毡层的形成相一致, 我们推测D5 可能与绒毡层的形成以及花粉的发育有关. 水稻基因转化以及反义技术的发展为我们研究基因的功能提供了途径. 在本研究中, 我 们首先采用 RNA 原位杂交技术对 D5 基因进行细胞定位, 然后通过反义转基因水稻揭示了 D5 基因在花粉发育过程中的可能作用. 1 材料和方法 ( ) 植物材料. 水稻( 中花八号, Oryza sativa L.var japonica Zhonghua 8) 在温室中栽培. 采集不同发育时期的小花, 固定后用于原位杂交. ( ) RNA 原位杂交. 用含有D5 基因的线性质粒作为模板, 体外转录反义及正义的地高 辛标记探针, 然后碱水解成合适大小. 按照Boehringer Mannheim 公司建议的方法制备地