炭疽诊断防治方法.docVIP

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2017-08-30 发布于重庆
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炭疽诊断防治方法.doc

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附件1 聚合酶链式反应（PCR）技术 1 试剂 1.1 消化液 1.1.1 1M 三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)(pH8.0) 三羟甲基氨基甲烷 12.11g 灭菌双蒸水 80mL 浓盐酸调pH至8.0 灭菌双蒸水加至100mL 1.1.2 0.5M 乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液 (pH8.0) 二水乙二铵四乙酸二钠 18.61g 灭菌双蒸水 80mL 氢氧化钠调pH至8.0 灭菌双蒸水加至100mL 1.1.3 20% 十二烷基磺酸钠(SDS)溶液 (pH7.2) 十二烷基磺酸钠 20g 灭菌双蒸水 80mL 浓盐酸调pH至7.2 灭菌双蒸水加至100mL 1.1.4 消化液配制 1M 三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)(pH8.0) 2mL 0.5mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液(pH8.0) 0.4mL 20% 十二烷基磺酸钠溶液(pH7.2) 5mL 5M 氯化钠 4mL 灭菌双蒸水加至200mL 1.2 蛋白酶K溶液蛋白酶K 5g 灭菌双蒸水加至250mL 1.3 酚/氯仿/异戊醇混合液碱性酚 25mL 氯仿 24mL 异戊醇 1mL 1.4 2.5mmol/LdNTP dATP(100mmol/L) 20μL dTTP(100mmol/L) 20μL dGTP(100mmol/L) 20μL dCTP(100mmol/L) 20μL 灭菌双蒸水加至800μL 1.5 8pmol/μL PCR引物上游引物ATXU（2 OD）加入701μl灭菌双蒸水溶解，下游引物ATXD（2 OD）加入697μL灭菌双蒸水溶解，分别取ATXU、ATXD溶液各300μL，混匀即为8pmol/μL 扩增引物。 1.6 0.5单位Taq DNA聚合酶 5单位Taq DNA聚合酶 1μL 灭菌双蒸水加至10μL 现用现配。 1.7 10×PCR缓冲液 1.7.1 1mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)( pH9.0) 三羟基甲基氨基甲烷 15.8g 灭菌双蒸水 80mL 浓盐酸调pH至9.0 灭菌双蒸水加至100mL 1.7.2 10倍PCR缓冲液 1mol/L三羟基甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)( pH9.