第2章微生物的纯培养和显微镜技术.docVIP

第2章 微生物的纯培养和显微镜技术 重点、难点剖析 1．无菌技术是最基本的微生物学实验操作技术，其核心是无菌概念的建立，以及正确而严格地按实验教材和实验课的要求，掌握在各种情况下的具体应用原则和操作规范。 2．分离获得某特定的微生物纯培养，是研究和利用微生物的基础。 获得纯培养的方法有固体培养基分离、液体培养基分离和单细胞挑取3大类(表2—1)，其中用固体培养基获得单独的微生物菌落是最常用、最基本的方法。此外还有活细胞或活体分离法，如噬菌体和动植物病毒纯培养的分离等。 表2-1 获得微生物纯培养的方法比较 方法 特点 应用 固体培养基分离 稀释倒平板法 菌落分离较为均匀，进行微生物计数结果相对准确。但操作相对麻烦，热敏感菌有时易被烫死，而严格好氧菌也可能被固定在培养基中生长受到影响 这3种方法可用于所有在固体培养基表面形成菌落的微生物的纯培养分离。并且，通过选用适当的选择平板及培养条件可直接分离各种具有特定生理特征的微生物。和厌氧罐或厌氧手套箱技术结合，这3种方法也可用于获 得各种厌氧菌的纯培养 涂布平板法 操作相对简单，是较常使用的常规方法。但有时会因涂布不均匀使某些部位的菌落不能分开，进行微生物计数时需对稀释和涂布过程的操作特别注意，否则不易得到准确结果 平板划线法 操作简单，多用于对已有纯培养的确认和再次分离 稀释摇管法 稀释倒平板的一种变通形式，但由于菌落形成在琼脂柱的中间，观察和挑取都相对困难 在缺乏专业的厌氧操作设备的情况下对严格厌氧菌进行分离和观察 液体培养基分离 稀释法 工作量大，是否获得纯培养需依靠统计学的推测 不能或不易在固体培养基上生长的微生物进行纯培养分离或数量统计 富集培养 一般不能直接获得微生物的纯培养，在通过富集培养使原本在自然环境中占少数的微生物的数量大大提高后，需再通过平板法进行相应富集培养微生物纯培养的分离和检测 1）根据某种微生物的特殊生长要求，按照意愿从自然界中对这种微生物进行有针对性的有效分离；2)分离培养出由科学家设计的特定环境中能生长的微生物，尽管我们并不知道什么微生物能在这种特定的环境中生长 显微操作 单细胞（孢子）挑取 分离过程直观，可靠，但对仪器和操作技术要求较高，多限于高度专业化的研究，而挑取的微生物单细胞 或孢子需经固体或液体培养基培养后才能获得其纯培养物 从样品中直接分离所需的微生物细胞或孢子，获得其纯培养 3．保证所用菌种性状的稳定是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。而目前使用的各种微生物保藏技术归纳起来不外乎生活态或休眠态两种。下面所列的是目前较为常用的一些微生物保藏方法。 培养基传代：斜面、半固体柱、平板等 生活态 常用的保藏技术 寄主传代 冷冻：低温冰箱、液氮罐 休眠态 干燥：沙土管、冷冻真空干燥 值得指出的是，由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种方法能被证明对所有的微生物均适宜。因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。 4．显微镜是微生物学研究的重要工具，对各类显微镜原理及应用特点的全面、综合了解是微生物学的重点内容之一(表2—2)。 表2-2 各类显微镜特点的比较 显微镜类型 基本原理及特点 应 用 光学显微镜 明视野显微镜 光线透射照明，物像处于亮背景中。为光学显微镜的量基本配置，价格便宜、容易使用 各种情况下染色样品或活细胞个体形态的观察 暗视野显微镜 通过特殊的聚光器实现斜射照明，亮物像形成于暗背景中 明视野显微镜下不易看清的活细胞的观察；不易被染色或易被染色过程破坏的细胞的观察（例如对梅毒密螺旋体的检测)；观察活细胞的运动性 相差显微镜 通过特殊的聚光器和物镜提高样品不同部位间的反差(明暗差异) 活细胞及其内部结构的观察 荧光显微镜 经荧光染料染色或荧光抗体处理的样品在紫外线照射下激发出各种波长的可见光，在黑暗的背景中形成明亮的彩色物像 环境微生物的直接观察；病灶或医学样品中特定病原微生物的直接检测（使用特定的荧光抗体） 共聚焦显微镜 激光作为光源，每次照明样品的一个点，连续扫描后经计算机处理获得样品的二维和三维图像。显微镜价格昂贵 对完整细胞的细微立体结构进行观察和