生物技术在食品致病微生物检测中应用.pptVIP

食品中致病微生物的检测技术 食品中致病微生物的检测技术 分子生物学技术运用到有食品检测方面，主要是针对一些有害微生物的核酸进行研究通过核酸杂交和核酸合成等反应快速检测样品中是否含有特定的有害微生物，并进一步确定其含量，其中最主要的技术包括PCR技术、DNA探针技术和基因芯片技术。 1.聚合酶链反应（PCR） （1）传统PCR技术 聚合酶链反应( polymerase chain reation, PCR)是1985年诞生的一项体外扩增DNA的方法，是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应，体外扩增特异DNA片段的技术。通过对人工难以培养的微生物相应DNA 或RNA 片段的扩增，检测扩增产物含量，从而快速的对饲料中致病菌含量进行检测。 李秀娟等（2009年）对117 株金黄色葡萄球菌的nuc片段进行了PCR 扩增和焦磷酸测序，结果显示所建立的PCR 方法能对117 株金葡菌进行准确检测，焦磷酸测序结果的一致性进一步验证了PCR 扩增结果的特异性，说明该方法针对目前所用的研究菌株而言，尚未出现假阳性和假阴性结果，具有较高的特异性。 传统PCR技术在实际应用中表现出一些缺陷，例如只能定性而不能定量地检测，且在有死细菌存在的情况下容易产生假阳性、不能检测致毒微生物产生的毒素等。 随着各项新技术的出现以及与PCR技术的有机结合，发展起来了一系列改进的PCR技术。 目前应用的方法主要有实时荧光定量PCR、多重PCR以及PCR联合技术等。 实时荧光定量PCR 实时定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量的方法。该方法可以对GMO 进行定量分析，目前已被一些国家的政府实验室采用。 杨柳等（2011年）根据沙门氏菌fimY 基因序列设计引物和探针, 采用基因重组技术构建用于沙门氏菌检测的定量标准品，成功构建了沙门氏菌重组质粒标准品和沙门氏菌实时荧光定量PCR 方法，具有较好的特异性、敏感性、稳定性和重复性。 多重PCR 多重PCR是常规PCR方法的改进，它是在同一个反应中同时扩增两个或多个目标基因序列。这种方法具有更大的可靠性和适应性，并且能降低检测成本。徐伟等（2009年）针对单增李斯特菌转录调节子基因prfA 和志贺氏菌侵袭性质粒抗原H 基因ipaH 设计引物， 采用多重PCR 对两种致病菌进行同步鉴定，提供了一种快速且特异性高的同步检测单增李斯特菌和志贺氏菌的方法。 PCR联合技术 传统PCR技术在实际应用中表现出一些缺陷，采用一些新技术与PCR结合，对PCR技术的完善和发展提供了有力的支持，并应用在致病菌检测中。 王永等（2009年)探讨以16S rDNA 保守区段为PCR扩增对象，运用SSCP技术对致泻大肠埃希氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌以及蜡样芽胞杆菌进行单链构象多态性分析，为食源性致病菌的快速鉴定提供方法依据。 刘成志等（2009年）根据志贺氏菌ipaH 基因的保守序列设计特异性引物，筛选合适的DNA 模板制备方法，采用快速常规PCR 和定量实时PCR 结合，对培养液中及乳饮料阳性样品中的志贺氏菌进行检测，建立乳饮料中快速检测志贺氏菌的有效方法。 杨大伟等（2011年）应用PCR 结合变性高效液相色谱( DHPLC) 技术，以A 型肉毒梭菌的A 型肉毒神经毒素基因作为靶基因设计特异性引物，PCR 扩增的产物经DHPLC 技术进行快速检测，最低检出限可达到为111ng /tube，该方法可以快速、准确检测A 型肉毒梭菌。 2. 核酸探针技术 根据核酸探针中核苷酸成分的不同，可将其分为DNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针，其中DNA探针是最常用的核酸探针。 DNA 探针技术又称分子杂交技术，是利用DNA分子的变性、复性以及碱基互补配对的高度精确性，对某一特异性DNA序列进行探查的新技术。 微生物经过处理后固定于另一固相表面上, 经洗涤变性后加入DNA探针进行杂交，DNA探针可以与同源性的靶DNA进行互补性结合，依据指示剂选用合适的方法进行检测。目前，DNA探针技术已经在沙门氏菌、产肠毒素大肠杆菌及乙型肝炎病毒等检测中得到了应用。?? 续文彬(2008年)针对单增李斯特氏菌hly部分基因设计探针，对肠炎沙门氏菌，大肠埃希氏菌，绿脓假单抱病菌，空肠/结肠弯曲杆菌等非单增李斯特氏菌经杂交保护分析后，只有单增李斯特氏菌为阳性结果，具有较好的特异性。 薛力刚等（2010年）通过吖啶酯标记核酸探针的方法检测病原菌，核酸探针与待检样品中金黄色葡萄球菌的rRNA 序列进行杂交，形成稳定的DNA: RNA 杂交体，使用碱液破坏未杂交探针，在碱性过氧化氢中检测发光。核酸探针法检测金黄色葡萄球菌大大缩短了检测周期，