硫磺矿硫化叶菌耐酸α-淀粉酶基区的克隆及其在枯草芽孢杆菌中的表达.pdfVIP

维普资讯 此研究由北京中天诺亚体育科技有限公司资助 硫磺矿硫化叶菌耐酸 一淀粉酶基因 的克隆及其在枯草芽孢杆菌中的表达 蒋专’杨慧芬’邱并生 汪兵 。杨建国 、。 (1北京科技大学土木与环境工程学院 100083；2中国科学院微生物研究所 100080； 5北京中天诺亚体育科技有限公司 100089) 在淀粉水解工艺中，耐高温 c【淀粉 酶的应用极大地提高了淀粉液化的效率。 以硫磺矿硫化叶茵基因组DNA为模板进行 PcR扩增，得到其淀粉酶基因。将该片段 与裁体 但 目前应用于工业上的地衣芽孢杆菌耐高 pSBPYF连接后转化枯草茅孢杆茼DB1542，得到重组茼株DB1542(pSBA)，对该茼株进行培养， 温 c【淀粉酶其最适pH为6．0左右…，液 经蔗糖诱导表达 ，在其上清中可检测到c【一淀粉酶活力，比空载体的淀粉酶活力高了5倍多。 化完成后进行糖化时所用的糖化酶最适 该酶作用的最适pH值为4．5，最适作用温度为80C，在酶液中添加不同的金属离子均降低酶活。 pH为4．5，需要进行pH值的调整，这样不 但增加了生产成本，而且会影响液化糖化 c【一 淀粉酶 ；硫磺矿硫化叶茼；克隆和表达；枯草茅孢杆 茼 效果，因此研究和开发耐酸的高温c【淀 粉酶将大大改进淀粉工艺，节约成本。 耐酸的cc 淀粉酶多来 自霉菌，但来 司 。 AE006718．1的核苷酸序列，设计合成如 自霉菌的c【一淀粉酶又大多不耐高温 。为 1．3培养基、培养条件及诱导表达 下引物： 此近年来研究者试从嗜热古菌中克隆和表 条件 上游引物 5一gCg，ACT，gCA，ggT， 达 耐 酸 的 高 温 c【 淀 粉 酶 ，其 中 细菌培养用LB培养基，枯草杆菌感 CAC，CAA，CCA，TTC，Agg，ATT，Ag一3 Pyrococcusfuriosus的胞外 c【一淀粉酶因 受态制备用GMI，GMII培养基，枯草杆菌 下游引物 5-ggA，CAA，gCT，1vrC， 其耐酸热的性质受到国内外研究者的广泛 工程菌表达用 2 ×MSR 培养基I1。B． AAT，CCT，1] ，CAT，TTC，CTA，ACC 3 关注，并将其在大肠杆菌，枯草芽孢杆菌 subtilis转化采用化学感受态转化法，淀 上游引物的5端含PstI酶切位点，下 以及酵母菌中进行了表达纯化及性质研究 粉酶基因的表达按文献 【8】进行。 游引物的5端含HindIII酶切位点。 [261 1．4分子克隆技术和表达产物的SDS 以硫磺矿硫化叶菌基因组DNA为模 o 而古菌Sulfolobussolfataricus由于 其生长最适pH值为3，最适温度85℃，其 一 PAGE分析 板进行PCR扩增。扩增条件为：96~C50s； c【淀粉酶是研究和应用耐酸的高温c【 参照文献 9【】进行。 57℃60s；72~C90s，30个循环，电泳检测 淀粉酶又一新的选择途径。由于嗜热古菌 1．5 酶活力测定方法 扩增产物约 1．3kb(图1)。 本身所产生的酶水平较低，该菌又很难培 养，其c【一淀粉酶的基因克隆和表达尚未 见报道。本工作首次从极端嗜热耐酸古菌 硫磺矿硫化叶菌中克隆到淀粉酶基因并在 枯草芽孢杆菌中得到表达，从而获得耐酸 的高温 c【 淀粉酶。 1，材料和方法 1．1材料 硫磺矿硫化叶菌(Sulf0l0buS solfataricusP2)基因组DNA为中科院微生 物所黄力教授惠赠。 质粒pSBPYF由本实验室构建。