实验大蒜细胞SOD的提取和分离.docVIP

实验23 大蒜细胞SOD的提取和分离 【实验目的】 通过大蒜细胞SOD的提取与分离，学习和掌握蛋白质和酶的提取与分离的基本原理和操作方法。 【实验原理】 超氧化物歧化酶（SOD）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。它可催化超氧负离子（O 2-）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢。大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用pH7.8磷酸缓冲液提取出。由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。自由基是具有 2.－未配对价电子的原子或原子团。生物体内产生的自由基主要有超氧自由基（O ）、羟自由基（OH）、 过氧自由基（ROD）、烷氧自由基（RO）等。植物细胞膜有酶促和非酶促两类过氧化物防御系统，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（ASA-POD）等是酶促防御系统的重要保护酶。抗坏血酸（VC）、VE和还原型谷胱甘肽（GSH）等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。SOD、CAT等活性氧清除剂的含量水平和O2.－、H2O2、OH. 和O2等活性氧的含量水平可作为植物衰老的生理生化指标。 SOD是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的SOD：Mn－SOD和Cu.Zn－SOD，它们可催化下列反应： 2.－ 2.－ O ＋O ＋2H＋SOD→HO＋O 2 2 2 HO＋CAT→HO＋1/2O 2 2 2 2 2.－ 由于超氧自由基（O ）为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD活性一般为间接方法。并利用各种呈色反应来测定SOD的活力。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O ，当加入NBT后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲月替（黄色），继而还原生成二甲月替，它是一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。当加入SOD时，可以使超氧自由基与H+结合生成H2O2 和O2，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲月替生成速度减慢。通过在反应液中加入不同量的SOD酶液，光照一定时间后测定560nm波长下各液光密度值，抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比，以酶液加入量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，在坐标纸上绘制出二者相关曲线，根据SOD抑制NBT光还原相对百分率计算酶活性。找出SOD抑制NBT光还原相对百分率为50％时的酶量作为一个酶活力单位（U）。 【器材与试剂】 一、器材 恒温水浴锅、冷冻高速离心机、可见分光光度计、研钵、玻棒、烧杯、量筒 二、材料和试剂 1、新鲜蒜瓣 2、0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8） 3、氯仿-乙醇混合液：氯仿:无水乙醇=3:5 4、丙酮：用前需预冷至4-10℃ 5、0.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH10.2） 6、0.1mol/LEDTA溶液 7、2mmol/L肾上腺素溶液 【实验步骤】 1、组织细胞破碎：称取5g大蒜蒜瓣，置于研钵中研磨。 2、SOD的提取：破碎后的组织中加入2-3倍体积的0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8），继续研磨20min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后在5000rpm下离心15min，取上清液。 3、除杂蛋白：上清液加入0.25体积的氯仿-乙醇混合液搅拌15min，5000rpm离心15min，得到的上清液为粗酶液。 4、SOD的沉淀分离：粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，5000rpm离心15min，得SOD沉淀。将SOD沉淀溶于0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）中，于55-60℃热处理15min，得到SOD酶液。 5、SOD活力测定 将