实验氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶活力.docVIP

氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶活力 原理超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶，它催化下列反应： 本反应产物H O2 可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除超氧阴离子自由基，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料水稻或小麦叶片。（二）仪器设备高速台式离心机，分光光度计，微量进样器，荧光灯（反应试管处照度为4000lx），试管或指形管数支。（三）试剂（1）0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）。（2）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml。（3）750μmol/L氮蓝四唑溶液称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。（4）100μmol/LEDTA-Na2溶液称取0.03721g EDTA-Na2，用磷酸缓冲液定容至1000ml。（5）20 μmol/L核黄素溶液称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml，避光保存。 实验步骤1、酶液提取取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。取1.5－2ml于000r/min下离心0min，上清液即为SOD粗提液。2、显色反应取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下表加入各种溶液：各溶液显色反应用量 130mmol/L 0.3 13mmol/L 750umol/L 0.3 75umol/L 100umol/L 0.3 10umol/L 20umol/L 0.3 2.0umol/L 酶液 0.05 2支对照管以缓冲溶液代替酶液 蒸馏水 0.25 总体积 3.0 混匀后将1支对照管置暗处，其他各管于4000lx日光下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高，时间缩短，低时延长）。3、SOD活性测定至反应结束后，以不照光的对照管作空白，分别测定其他各管的吸光度。四、结果计算已知SOD活性单位以抑制NBT光还原的50％为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。SOD总活性＝式中：SOD总活性以每克鲜酶单位表示；A 为照光对照管的吸光度；A 为样品管的吸光度；V为样品液总体积ml);Vt 为测定时样品用量ml)；W为样鲜重g)。