变性梯度凝胶电泳_DGGE_在微生物生态学中应用_马悦欣.pdfVIP

第23 卷第8 期 生　　态　　学　　报 Vol. 23,No. 8 2003 年 8 月 ACTA ECOLOGICA SINICA Aug. , 2003 ( DGGE) 1, 2 2 2 2 , Carola Holmstr m , J r my W bb , Staffan Kj ll b rg ( 1. 大连水产学院生命科学与技术学院, 大连　116023; 2. School of Biot chnology an d Biomol cular Sci nc s, Th Univ rsity of N w South Wal s, Sydn y　2052, Australia) : 由于从环境样品中分离和培养细菌的困难, 分子生物学方法已发展用来描述和鉴定微生物群落。近 年来基于DNA 方法的群落分析得到了迅速的发展, 如P CR 扩增技术, 克隆文库法, 荧光原位杂交法, 限制 性酶切片段长度多态性法, 变性和温度梯度凝胶电泳法。 DGGE 已广泛用于分析自然环境中细菌、蓝细菌, 古菌、微微型真核生物、真核生物和病毒群落的生物 多样性。这一技术能够提供群落中优势种类信息和同时分析多个样品。具有可重复和容易操作等特点, 适 合于调查种群的时空变化, 并且可通过对切下的带进行序列分析或与特异性探针杂交分析鉴定群落成员。 DGGE 分析微生物群落的一般步骤如下:一是核酸的提取, 二是16S rRNA, 18S rRNA 或功能基因如 可容性甲烷加单氧酶羟化酶基因(mmoX) 和氨加单氧酶A-亚单位基因( amoA ) 片段的扩增, 三是通过 DGGE 分析 PCR 产物。DGGE 使用具有化学变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶, 该凝胶能够有区别的解链 PCR 扩增产物。由PCR 产生的不同的DNA 片段长度相同但核苷酸序列不同。因此不同的双链DNA 片段 [5] 由于沿着化学梯度的不同解链行为将在凝胶的不同位置上停止迁移 。DNA 解链行为的不同导致一个凝 胶带图案, 该图案是微生物群落中主要种类的一个轮廓。 使用所有生物中保守的基因片段如细菌中 DGGE 的16S rRNA 基因片段和真菌中的18S rRNA 基因片段。 然而同其他分子生物学方法一样, DGGE 也有缺陷, 其中之一是只能分离较小的片段, 使用于系统发 育分析比较和探针设计的序列信息量受到了限制。在某些情况下, 由于所用基因的多拷贝导致一个种类多 于一条带, 因此不易鉴定群落结构到种的水平。此外, 该技术具有内在的如单一细菌种类 16S rDNA 拷贝 之间的异质性问题, 可导致自然群落中微生物数量的过多估计。 DGGE 是分析微生物群落的一种有力的工具。不过为了减少DGGE 和其它技术的缺陷, 建议研究者结 合DGGE 和其它分子及微生物学方法以便更详细的观察微生物的群落结构和功能。 :DGGE; 微生物生态学; PCR; rRNA ( ) Application of denatur ing gr adient gel electrophor esis DGGE in microbial ecology 1, 2 2 2 2 - , , , 　( 1. School of Lif MA Yu Xin Carola H olmstr m J r my W bb Staffan Kj ll b rg : 国家留学生基金委员会海洋生