烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶.docVIP

实验八　　聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶 一、实验目的 　１　学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。 　２　掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板（及同盘）电泳的操作技术。 　３　掌握同工酶定义、理化性质的差异，了解过氧化物酶的染色原理。 　４　掌握过氧化物酶的活性的测定。 二　实验原理 　聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acr）和交联剂（即共聚体的N,N－甲叉双丙烯酰胺　Bis）在加速剂（N,N,N’,N’－四甲基乙二胺　TEMED）和催化剂（过硫酸胺 (NH4)4S2O8 简称AP）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。 （一）聚丙烯酰胺凝胶聚合原理及相关特性 １　聚合反应 聚丙烯酰胺是由Acr和Bis在催化剂（AP）或核黄素①　AP-TEMED 　　属化学聚合作用 　②　核黄素①　凝胶性能与总浓度及交联度的关系 　　　凝胶的孔径、机械性能、弹性、透明度、粘度和聚合程度取决于凝胶总浓度和Acr与Bis之比：　　　　　　　　a:b10 脆硬乳白　 交联度：　　　　　　　　　　 a:b100糊状易断 　②　凝胶浓度与孔径的关系 　　　T（Acr和Bis总浓度）增加　孔径减小　移动颗粒穿过网孔阻力增加 　③　凝胶浓度与被分离物分子量的关系 　　　分子量增加　阻力增加　移动速度减慢。同时还与分子形状及分子电荷有关系。 　　　在操作时，可以选用凝胶。因为生物体内大多数蛋白质在此范围内电泳均可取得满意的结果。 ３　试剂对凝胶聚合的影响 水中金属离子或其他成分对凝胶电泳的电泳速度、分离效果等有影响。 （二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）原理 根据有无浓缩效应可分为： 连续系统：电泳体系中由于缓冲液PH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场中主要靠电荷及分子筛效应。 不连续系统：电泳体系中由于缓冲液离子成分、PH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还有浓缩效应。因而其分离带清晰度及分辨率高。 垂直板电泳：凝胶是在两块间距几毫米的平行玻璃板中聚合。 垂直圆盘电泳：凝胶是在玻璃管中聚合，样品分离区带染色后呈圆盘状。 （三）过氧化物酶染色原理 　　　过氧化物酶催化过氧化氢释放活性氧，进一步氧化联苯胺使之由蓝色变为褐色。属于活性染色，若酶失活，则不能变色。 （四）过氧化物酶活性的测定原理 过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在下过氧化物酶能使愈创木酚氧化生成褐色物质，可用分光光度计测量生成物的含量，以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以A470/min.mg蛋白质表示 三　实验器材 １　电泳仪（600V）及盘状电泳电泳槽 ２　电泳玻璃管（用碱性较低的玻璃管），内径5－7mm，长80－100mm ３　玻璃架 ４　微量注射器或微量吸管 ５　带长针头的注射器 ６　日光灯 ７　带有玻璃珠或玻璃棒的一小段乳胶管 四　试剂和材料 １　贮液和工作溶液的配制 ２　染色液的配制 A液：称取0.4g联苯胺，加入３ml冰醋酸，溶解后加入１７ml蒸馏水　随用随配 B液： NH4Cl　C液：　EDTA(PH6.0)　D液： H2O2 按A：B：C：D＝1：1：1：８比例配制 ３　测酶活力所需试剂 20mmol/l KH2PO4 H2O2 愈创木酚　　100mmol/l磷酸缓冲液（PH=6.0） 反应混合液：100mmol/l磷酸缓冲液（PH=6.0）50ml于烧杯中，加入愈创木酚28l于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解。冷却后加入H2O2 19l 混合均匀保存于冰箱中。 ４　酶液的制备 （１）材料：萌发３－６天的高粱　玉米　小麦种子 （２）步骤：称取不同植物材料幼苗茎部1g　加入20mmol/l KH2PO4 10ml于研钵中研磨成匀浆，以4000r/min 离心15min。倾出上清液，测出总体积放于冷处。 五　操作步骤 １　过氧化物酶活性的测定 取２只光径1cm的比色板，１只中加入反应混合液３ml、KH2PO4　1ml 作为校零对照，另一只加入反应混合液３ml、酶提取液１ml　立即开启，秒表记时，于分光光度计上测量吸光值。每隔一分钟计数一次。 （A470= ） 酶活力 = ————————— ２　凝胶的制备 （１）分离胶的制备：（小孔径凝胶）PH8.9　凝胶浓度 将贮液按１号：２号：水：３号＝5ml：10ml：5ml：20ml比例混匀。用带长针头的注射器快速加入玻璃管中（或两层玻璃板之间），高度约3/4。沿壁加入3－5ml蒸馏水用于隔绝空气，使胶面平整。静置30－60min完成聚合，用滤纸吸去水分。 （２）浓缩胶制备：（大孔径凝胶）PH6.7　凝胶浓度 将贮液按４号：５号：６号：７号＝３ml：6ml：3ml：12ml比例混匀，按上述方法加到分离胶上方距离管上缘0.5cm处（或两层玻璃板之间，放上样品槽模