超氧化物活性的测定.docVIP

超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定 【实验原理】 SOD是含金属辅基的酶，它催化以下反应： ? 02-+02-+ 2H+?? H202+02 ? 由于超氧阴离子自由基02-寿命短，不稳定，不易直接测定SOD活性,而采用 间接的方法。目前常用的方法有3种, 包括氮蓝四唑(NBT)光化还原法，邻苯三酚自氧化法，化学发光法。本实验主要介绍光化还原法，其原理是：氮蓝四唑在蛋氨酸和核黄素存在条件下，照光后发生光化还原反应而生成蓝色甲腙，蓝色甲腙在560nm处有最大光吸收. 。SOD能抑制NBT的光化还原，其抑制强度与酶活性在一定范围内成正比。 ? 试剂: 　1.50m mol/l pH7.8的磷酸缓冲液(PBS) 。含0.1m mol/l EDTA ? 2.220m mol/l甲硫氨酸：称3.2824g甲硫氨酸\,用50m mol/l pH7.8的磷酸缓冲液定溶至100ml（现配现用）。 ?3.1.25m mol/l氯化硝基四氮唑蓝（NBT）溶液（现配）：称NBT 0.102g,用 ?50m mol/l pH7.8的磷酸缓冲液(PBS)溶解定容至100ml. ? ?4.0.033m mol/l核黄素：称2.52mg 用PBS溶解定容至200ml（遮光保存）。 【实验步骤】 1．酶液制备 称取植物组织0.5g先加入2.5ml PBS，研磨匀浆后，再加入2.5ml PBS混匀， 4℃下?10000r/min离心15min 上清液即为粗酶液。取部分上清液经适当稀释后用于酶活性测定。 2.酶活性测定 取10ml小烧杯7只, 3只测定样品,4只作为对照， 按下表加入试计:? ? ? 试剂 用量(ml ) 终浓度(比色时) 50m mol/l?? (PBS) 220m mol/l?? Met 1.25m mol/l?NBT 0.033m mol/l核黄素 酶液 总体积 ??????? 4.05 ???????? 0.3 0.3 ???????? 0.3 ???? 0.05 5.0 ? 13m mol/l 75μ mol/l 2.0μ mol/l 对照以缓冲液代替酶液 ?? 将上述试剂混匀后，1只对照烧杯至于暗处，另3只对照烧杯和样品一起置于 4000lx日光灯下反应20min（要求各管受光一致，温度高时时间缩短，温度低时可适当延长）。 最后在560nm处测定反应液的光密度。以不照光的对照烧杯作参比，分别测定其 他各管的光密度。 3.蛋白含量的测定 步骤1的上清液经适当稀释后用考马斯亮蓝 G-250法测定蛋白含量. 【实验结果及计算】 ? SOD活性单位是以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示。可按下式计 ? 算SOD活性： ? SOD总活性= ? ? SOD比活力=SOD总活性/蛋白质总浓度 ????? 式中: SOD总活性以 U/gFW,比活力单位以?U/mg蛋白表示 ACK为对照杯(光照)的光吸收值;AE为样品的光吸收值;V为样液总体积,V1为测定时样品用量,W为样重g. 过氧化物酶(POD)活性的测定 ? 【实验原理】 植物体内的黄素氧化酶类代谢产物常包含H202 ，如光呼吸中的乙醇酸氧化酶、呼吸作用中 的葡萄糖氧化酶等。H202的积累可导致破坏性的氧化作用。过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)是清除H202的重要保护酶，能将H202分解为02和H20,从而使机体免受H202的毒害作用。其活性与植物的抗逆性密切相关。 (CAT)催化如下反应： ???????????????????? 2 H202→2 H20+ 02 本实验通过测定H202的减少量来测定CAT的活性。 在H202存在条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色的4-邻甲氧基苯酚。可用分光光度计测生成物的含量来测定活性。 【试剂药品 1.50m mol/l pH7.0的磷酸缓冲液 2.0.3% H202: 吸0.5ml 30% H202 加入pH7.0的磷酸缓冲液至 50ml 3.0.2% 愈创木酚 :秤0.2g愈创木酚加入pH7.0的磷酸缓冲液至 100ml 【实验步骤】 ?酶液的制备 ?1.称取叶片 0.25g ，加入5倍量的（M/V）pH7.0 的PBS?冰浴研磨 15000r/min ?离心15min取部分上清液经适当稀释后用于酶活性测定。 ?2. CAT活性的测定 在3ml的反应体系中，包括0.3% H202?1ml, H20 1.95ml, 最后加入0.05ml酶液 启动反应，测定波长240nm处的OD降低速度。将每分钟OD减少0.01定义为1个活力单位。 ?3. POD活性的测定 ??在3ml的反应体系中，包括0.3% H202?1ml, .0.2% 愈创木酚0.95ml,pH7.0的PBS 1ml，最后加入0.05ml酶液启动反应，记录4