同源重组敲除MSTN基因猪胎儿成纤维细胞构建.pdfVIP

中国农业科学 2009,42(8):2972-2977 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2009.08.041 同源重组敲除MSTN基因的猪胎儿成纤维细胞的构建 １ ２ 3 4 李景芬 ，于 浩 ，袁 野 ，刘 娣 1 2 3 （湖州师范学院生命科学学院，浙江湖州 313000 ；吉林大学农学部畜牧兽医学院，长春 130062 ；公安部警犬技术学校警犬技术系，沈阳 110034 ； 4 黑龙江省农业科学院，哈尔滨 150086 ） 摘要：【目的】获得敲除肌肉生长抑制素（MSTN）基因的猪胎儿成纤维细胞。【方法】打靶载体的构建：以Neo 为正筛选基因、HSV-tk 为负筛选基因。在 Neo 的两侧分别插入同源长臂和同源短臂。同源长臂 5 382 bp，包含 MSTN 基因的部分 5′端，全部的 exon1，intron1 和 exon2 及大部分 intron2；同源短臂 844 bp，包含部分 exon3 及3′端的部分序列。取35 d胎龄的大白猪，用胰酶消化法，分离胎儿成纤维细胞并对其进行培养和建系。采用脂 质体法将打靶载体导入胎儿成纤维细胞中，转染后的细胞采用 250 μg·ml-1 -1 G418 筛选 7 d，再用 200 μg·ml G418+2µmol·L-1 GANC 维持筛选。用 RT-PCR 法检测转染前转染后细胞 MSTN 基因表达量。【结果】成功构建了对猪 MSTN 基因部分 intron2 和 exon3 区域进行敲除的替代型打靶载体。共得到 5 个具有药物抗性的细胞克隆，经 PCR 检测，其中一个细胞克隆发生了正确的同源重组。转染后细胞MSTN基因表达量明显降低。【结论】获得了敲除MSTN 基因的猪胎儿成纤维细胞。 关键词：猪；胎儿成纤维细胞；基因打靶；肌肉生长抑制素 Construction of MSTN Knock-out Porcine Fetal Fibroblast 1 2 3 4 LI Jing-fen , YU Hao , YUAN Ye , LIU Di 1 2 ( School of Life Sciences, Huzhou Teachers College, Huzhou 313000, Zhejiang; Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Jilin University, Changchun 130062 ; 3Department of Policedog Technique, School of Policedog Technique of MPS, Shenyang 110034; 4Heilongjiang Academy of Agricu