食品中转基因成分定量检测与研究.pdf

食品中转基因成分的定量检测研究 硕士研究生： 吴永彬 指导教师： 马文丽教授 摘 要 随着转基因作物在全世界范围内的广泛种植，其食用安全和环境安全问题 一直受到广大消费者和各国政府及相关机构人员的重视。很多国家和地区纷纷 制定转基因生物安全管理法规，实施标签制度，并积极发展转基因食品检测监 测技术。转基因食品检测技术的广泛应用导致阳性对照的需求量也在增加。传 统标准分子的构建通常是以转基因材料与其对应的非转基因材料按一定的质量 比例配制而成，从而获得一系列质量分数的标准品。然而，由于我国对转基因 标准品的严格控制，许多转基因品系的标准样品很难得到。而包含有内源基因 和外源基因以质粒形态存在的标准分子，具有稳定性好、用量少、易保存、易 获得等优点，因此，构建阳性质粒标准分子作为转基因食品检测的阳性对照材 料已成为近几年来的新型阳性材料研究的热点。目前，食品中的转基因成分检 测已从定性提高到定量水平，由于传统定量PCR技术在到达扩增平台期时才开 始定量检测，而不能消除每个靶基因扩增效率的差异产生的定量误差，导致传 统定量PCR存在较大缺陷。理想条件下，每个循环PCR扩增的反应效率一致， PCR反应后DNA浓度与最初的目标DNA量是成正比。然而，扩增效率在不同 的反应之间，或在同一反应的不同循环中在不断变化，特别是在PCR循环反应 的后期，扩增产物以未知的反应速率呈非指数形式扩增。为使检测的灵敏度达 到最高，常规PCR大多采用终点定量法，此时扩增产物量达到最大(即“平台 摘要 期’’)。但由于试剂的消耗以及聚合酶的逐渐失活，终产物的浓度和目标分子的 初始浓度间的相互关系很难确定。近年来发展的实时荧光定量PCR技术是集 PCR和探针杂交技术优点为一体，通过探测整个PCR过程中的荧光信号变化， 准确定量DNA模板量，其检测灵敏度比常规PCR技术高100倍左右，可检测 到每克样品中含2pg转基因DNA量，且对深：jn-r_产品和混合样品都可进行定 量检测。相对于终点定量方法，实时荧光定量PCR反应体系可以随反应的实际 进程实时监控整个反应变化。在实时荧光定量PCR中，PCR反应扩增产物的 量和荧光信号的释放联系在一起，而且成一定比例，随着每个循环中PCR扩增 产物量的增加，荧光信号也会成比例增加。记录每个循环中释放的荧光信号量， 就可以监控整个指数期中PCR扩增反应的情况。 本文旨在研制几种常见的转基因作物的质粒标准分子并提供一套简便、准 确、高效的转基因食品定量检测技术体系，以解决阳性标准品的缺乏和深加工 制品检测繁琐、可信度差等技术难题。这为我国主要粮食作物转基因食品定量 检测标准化提供技术平台，为建立完善的切实可行的深加工制品检测体系及 GMO标签制度有效实施提供技术保证，同时为转基因食品标识、环境安全与 使用安全的检测及长期跟踪监测、监控和安全隐患的预测、预警进而提供技术 支撑。全文主要围绕定量PCR检测方法进行研究，参考我国最新国家标准、农 业部公告、出入境检验检疫行业标准和欧盟标准等收集转基因材料，建立了5 品系各一个，这些物种涵盖了我国已批准和即将批准的主要进出口转基因植物。 检测的靶序列包括内源基因和品系特异性序列共约20个常见基因序列。以标准 样品作为初期研究对象，验证、优化这些基因的最佳反应条件和反应体系，在 获得稳定、准确、高效的检测方法后，将之应用于转基因植物种子、饲料、食 Ⅱ 硕士学位论文 品等初加工和深加工食品的检测中。同时本文还构建了13个品系共9个新型质 粒标准分子，并对其在实时荧光定量PCR检测体系中的灵敏度、稳定性和精确 性等指标做了进一步分析，建立了13个转基因植物品系的定量PCR检测方法， 采用Taqman探针法对这些物种的品系特异性序列进行定量分析并有效地应用 到初加工和深加工等食品的转基因成分的检测中。 在质粒标准分子的研制中，本部分采用重叠延伸PCR成功构建了转基因大 豆、玉米、油菜、大米、甜菜5个常见物种13个品系的质粒标准分子，该技术 与传统的酶切连接方式不同，它不需要限制性内切酶和连接酶即可实现DNA 片段的体外快速连接。有研究者指出为了最大限度地避免碱基的错配，重叠延 伸PCR反应一般采用高保真DNA聚合酶，而