靶向胶质瘤干细胞药物筛选模型及诺帝抗胶质瘤干细胞作用的研究.pdfVIP

中华医学会病理学分会2010年学术年会论文汇编 大会发言 A-08 靶向胶质瘤干细胞药物筛选模型及诺帝抗胶质瘤干细胞作用的研究 王斌，卞修武。平轶芳，姜建勇。赵林涛，余世沧，王吉古 第三军医大学西南医院病理学研究所400038 引言 近年来研究显示肿瘤干细胞维持在恶性肿瘤的多种获得性生长优势如异常增殖、组织 浸润、凋亡抵抗、血管生成等中发挥着关键作用[1]。其中与临床肿瘤治疗关系最为密切的 是其高度的侵袭转移和治疗抵抗能力[2]，这提示肿瘤治疗和抗癌药物的筛选必须关注治疗 手段对肿瘤干细胞的靶向性和选择性[3]。可以推测，选择性靶向肿瘤干细胞的药物不一定 会在短期内缩小肿瘤体积，但是肿瘤干细胞的耗竭终将导致肿瘤的消退。然而以往的抗癌 药物评价多局限于检测肿瘤生长速度和体积大小，因此目前尚无针对肿瘤干细胞的抗癌药 物筛选模型。本研究拟建立靶向胶质瘤干细胞(GSCs)的抗癌药物初筛模型，并以此为模 型检测抗癌化合物诺帝[4—5]对胶质瘤干细胞是否具有治疗效应。 材料与方法 l。GSCs的培养和GSCs始动的移植瘤模型的构建：GSCs来源于在裸鼠体内连续传代的胶 质母细胞瘤U87细胞株(来源于ATCC)移植瘤。将移植瘤均匀剪碎为约lmm3大小组织 悬液后接种于神经干细胞培养基(接种密度为lO细胞／u1)，每2天半量换液，培养7天获 得GSCs细胞球。接种l×105GSCs入裸小鼠左腋下(BALB／cnu／nu，雌性，4-6周，体 重16209，由第三军医大学实验动物中心提供)，标准条件饲养，建立GSCs始动的移植 瘤模型。 2．药物治疗和监测方案：为了解诺帝预处理GSCs其对始动移植瘤发生能力的影响，分别 以终浓度为50uM和100uM的诺帝处理神经干细胞培养基中培养的GSCs48小时，以未 处理正常培养的GSCs为对照(n=5／组)。苔盼蓝染色计数活细胞比例，按上述方法接种等 量活细胞(1x105)至裸小鼠左腋下，第6周取移植瘤测量体积。为评价诺帝体内治疗对 移植瘤生长的影响，将方法l中建立的GSCs移植瘤模型分诺帝13．5mg／kg、诺帝27mg／kg、 BCNU 20mg／kg和PBS组(n=8／组)，从第lO天开始分别给予4个周期的药物治疗。每个 周期腹腔注射给药，诺帝1次／2日，Ba叮U1次／4日，第4天以游标卡尺测量移植瘤最长 径(L)和最宽径(、聊，依据公式(V(体积)=L×W2／2)计算移植瘤的体积。 3．流式细胞术分析CDl33+细胞比例：在第4个治疗周期末即皮下接种GSCs第26天， 从每组中各取4只裸鼠麻醉处死，取皮下移植瘤按方法l剪碎消化获得单细胞悬液，神经 干细胞培养基中短暂培养6小时。收集细胞，以鼠抗人IgG2b作同型对照，4。C孵育PE． Biotec公司30rain，洗涤3次重悬，使用流式细胞仪检 CDl33／2抗体(鼠抗人，Miltenyi 测CDl33+细胞比例。 4．成球能力检测：收集第26天皮下移植瘤，按方法3所述获得单细胞悬液，采用梯度稀 释法用神经干细胞培养基稀释移植瘤细胞至细胞密度为100／ml，接种96孔板0．1ml／孑L，倒 置相差显微镜下标记单个细胞孔．置孵箱培养。每三天添加生长因子混合液，2周后镜下 计数含细胞数大于50的细胞球数目。成球比例；细胞球数／单细胞孔数。 5．免疫荧光检测移植瘤中GSCs和分化细胞标志物：获取移植瘤组织后立即使用冰冻包埋 剂包埋，在．20℃冰冻切6岬组织片，贴附于多聚赖氨酸包被的盖玻片，40c丙酮固定20 ．19． 大会发言 中华医学会病理学分会2010年学术年会论文汇编 分钟，室温晾干后保存。免疫荧光染色采用用正常山羊血清封闭，一抗4。C孵育过夜(兔 司：小鼠抗人Ⅺ．67，北京中杉公司；正常小鼠IgG为空白对照)；加入异硫氰酸荧光素(FITC， 北京中杉公司)或四乙基罗达明异硫氰酸盐标记的二抗(TRITC，北京中杉公司)；使用 TCS SP2)下观 碘化丙啶(PI，Sigma公司)染核，缓冲甘油封片；激光共聚焦显