多克隆抗体制备—Elisa.pptVIP

主 要 内 容 实验分组及材料 主要操作步骤 检测方法--Elisa 试剂: 抗原：OVA（卵清蛋白） 抗体： 一级抗体：小鼠血清 二级抗体：HRP-Ab 封闭液：1% BSA 包被缓冲液 抗体稀释液：PBS 　 洗液：PBST 底物溶液：OPD 终止液：2M 硫酸 弗氏完全佐剂 弗氏不完全佐剂 免疫小鼠 免疫方式 肌肉注射（intramuscular injection ，i.m.） 腹腔注射（intraperitoneal injection，i.p. ） 皮下注射（subcutaneous injection，s.c.） 静脉注射（intravenous injection ，i.v.） 抗原：OVA 7天免疫一次，共三次 免疫佐剂 弗氏佐剂(Immunoadjuvant ) 完全弗氏佐剂（石蜡油+羊毛脂+卡介苗） 不完全弗氏佐剂（石蜡油+羊毛脂） 细胞因子 IL-2、IL-1、IFN-γ、IL-12、GM-CSF 制备血清 摘取小鼠眼球，用1.5ml EP管接血。 4000rpm，离心10分钟，吸取上清（血清）待用。 拉颈处死小鼠。 免疫小鼠血清抗体效价测定 酶联免疫吸附（ enzyme-linked immunosorbent assay ， Elisa ） 利用抗原抗体反应的高度特异性和酶对底物高效催化性，将抗原或抗体吸附于固相载体表面，通过底物的显色反应鉴定抗原抗体结合的反应 Elisa 酶联免疫吸附（ enzyme-linked immunosorbent assay ， Elisa ） 利用抗原抗体反应的高度特异性和酶对底物高效催化性，将抗原或抗体吸附于固相载体表面，通过底物的显色反应鉴定抗原抗体结合的反应 固相载体 固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。可作ELISA中载体的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。 包被 抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。 蛋白质与固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的相互作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的，大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面 。 Enzyme 常用的酶 辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP) 碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。 葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。 HRP的底物 HRP催化过氧化物的氧化反应，最具代表性的过氧化物为H2O2，其反应式如下：DH2+ H2O2 → D+ H2O上式中，DH2为供氢体， H2O2为受氢体。在ELISA中，DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物，以便作比色测定。 常用的供氢体有 邻苯二胺(O-phenylenediamine,OPD) 四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine,TMB) ABTS[2,2’-azino-di-(3-ethylbenziazobine sμLfonate-6)]　 OPD OPD氧化后的产物呈橙色，用酸终止酶反应后，在492nm波长处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。 OPD本身难溶于水，OPD·2HCl为水溶性。OPD见光易变质，与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定，须现配置现用(用pH5.0的磷酸—枸缘酸缓冲液。再加入邻苯二胺至终浓度4～10mg/ml，充分溶解，最后加入30%H2O2 25μl） OPD产物用硫酸终止后，显色由橙黄色转向棕黄色 　 TMB TMB经HRP作用后产物显蓝色，目视对比鲜明。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液，可直接作底物使用。 TMB无致癌性，因此在ELISA中应用日趋广泛。酶反应用HCl或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为405nm。 ELISA的应用 ELISA是目前应用最广泛的免疫学检测技术之一，常用来测量机体的可溶性的抗原或抗体。 由于它敏感性高，可测微量的的抗体或激素、细胞因子及粘附分子等抗原性物质。 成品的试剂盒，已广泛用于临床某些疾病的诊断。 ELISA分类 直接法——一抗带酶 间接法——二抗带酶 双抗夹心法——检测抗原 直接夹心法 间接夹心法 Antibodies are added and incubated wit