人乳头瘤病毒18型E6蛋白真核表达载体的构建及其在子宫颈癌细胞株Hela细胞中的表达.pdfVIP

中国实验诊断学 2010年 2月 第 14卷 第 2期 ～ 159 一 文章编号：1007—4287(2010)02—0159—03 人乳头瘤病毒 18型E6蛋白真核表达载体的构建 及其在子宫颈癌细胞株 Hela细胞 中的表达 卫 莹，朱 靖，王青元，范少君，李 敏，肖卫华，凌 斌，周 颖 (1．安徽医科大学附属省立医院 妇产科分子实验室 安徽省分子医学重点实验室，安徽 合肥230001； 2．中国科技大学生命科学院 免疫学研究所) 摘要：目的 构建并鉴定p3×flag-myc—CMV一24．HPV18E6真核表达载体，并转染 Hela细胞后，检测其在Hela细胞 中的表达。方法 用RT-PCR法从 Hela细胞中扩增出带HindII、SalI酶切位点的HPV18E6基因片段，将 HPV18E6基 因片段连接到pMD18T载体上，通过限制性内切酶 Hind1]／、SalI酶切，T4连接酶连接到含有上述酶切位点的p3×flag- myc．CMV-24真核表达载体上，通过脂质体将 p3×flag-mye—CMV．2 HPV18E6转染入 Hela细胞 48h后 ，Westem．blot检 测 HPV18E6及3×flag表达情况。结果 p3×flag-myc-CMV-24一HPV18E6真核表达载体构建成功，构建的真核表达载 体可以被限制性内切酶HindⅢ、SalI切开 ，电泳可显示相应条带，经测序其序列与设计的一致 ，转染到 Hela细胞48h 后经Western-blot检测可见HPV18E6的高表达及flag的表达。结论 p3×flag-myc—CMV-24HPV18E6真核表达载体的成 功构建为进一步研究 HPV18E6的致癌机制奠定了基础。 关键词：Hela细胞；真核表达载体 ；HPV18E6；flag 中图分类号：R730．231 文献标识码 ：A Constructionofp3×flag-myc-CMV-24-HPV18E6fusiongeneexpressionvectoranditsexpressioninHelaCells WEIYing， ZHU ，WANGQing-yuan，eta1．(Moc~arlaboratoryDepartmentofObstericsandGynecology，AnhuiProvincialHospital 一 edtoAnhuimedicaluniversity，Hefei230001，Ch,／~) Abstract：Objective Toconstructp3×flag-myc—CMV一24一HPV18E6fusiongeneineukaryotieexpressionvectorandtestitsex— pressioninHelacells．Methods m 18E5genesequencewithHind]]InadSal工restrictionenzymecuttingsitewereamplifiedfrom totalRNAofHelacelllinebyreversetranscription-polymerasechainreaction(RT-PCR)，thentheHPV18E6geneseuqencewasin— se~edintopMD-18Tvector．AfterenzymecuttingbyHindⅢ andSalI，useT4ligasetoformhteeukaryoticexpressionvectorp3× flag-myc—CMV一42一HPV18E6．Theplasmidp3×flag-myc—CMV-24一HPV18E6weretransfectedintohteHelacells．W estem-blotwere usedtotesthteexpressionlevelsofflag nadHPV18E6after48h．Results Th ep3×flag-mye-CMV一42一I-IPV18E6eukaryoticexpres— sionvectorwassuccessfully