第二章 基因工程制药.pptVIP

内容 第五节 基因的表达 第六节 基因工程菌的稳定性 第七节 基因工程菌的发酵(自学) 第八节 基因工程药物的分离纯化(自学) 第九节 基因工程药物的质量控制 第十节 基因工程药物制造实例 第五节 基因表达 1、概述 2、基因工程对宿主细胞的要求 3、宿主细胞的种类 概述 1、基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。 2、基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下一个外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得既有原生物活性又可高产的表达产物。 3、克隆蛋白质药物基因的一个主要目的使为了高效的表达该基因，从而大量地市场原本难以获得的药物。 4、进行基因表达研究的主要问题是目的基因的表达产量、表达产物的稳定性、产物的生物学活性和表达产物的分离纯化。因此，建立最佳的基因表达体系，是基因表达设计的关键。 4、大肠杆菌的表达不存在翻译后修饰作用，故对蛋白质产 物不能糖基化，因此，在应用上受到一定的限制。 5、目的蛋白质的N端常多余一个甲硫氨酸残基，容易引起免疫反应。 6、大肠杆菌会产生很难除去的内毒素，还会产生蛋白酶而破坏目的蛋白质。 真核基因在大肠杆菌中的表达形式 1、以融合蛋白的形式表达药物基因 2、以非融合蛋白的形式表达药物基因 3、分泌型表达药物基因 链霉菌 1、不致病、使用安全； 2、分泌能力强、可将表达产物直接分泌到培养液中； 3、表达产物可糖基化； 4、作为外源性基因表达受到重视。 主要基因工程表达体系比较 第六节 基因工程菌的稳定性 一、质粒不稳定产生的原因 分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。(常见) 结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、 缺失所致工程菌性能的改变。 二、工程菌的质粒不稳定因素： 1、含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率； 2、这两种菌的生长速率差异的大小。 质粒稳定性的分析方法 样品 菌种 一级种子摇瓶 二级种子罐培养 扩大培养 原料 发酵培养 灭菌 发酵生产 代谢产物分离 基配制 微生物工业发酵过程简图 第八节 基因工程药物的分离纯化 一、概述 二、基因工程药物的特点 三、分离纯化工艺的根据（自学） 四、分离纯化的技术 概述 由于基因工程药物是从转化细胞、而不是从正常细胞生产的，所以对产品的纯度要求也要高于传统产品。 基因工程药物的分离纯化一般不应超过4-5个步骤包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工。 分离纯化工艺的根据 1、含目的产物的起始物料的特点： 利用基因工程菌进行发酵生产的产物，其上游过程中的各种因素均对分离纯化技术和工艺有直接影响。 （1）菌种类型及其代谢特性：包括菌种的生物学性质，产物和副产物种类、产物在细胞内所处的位置，表达方式（胞内、胞外、包含体），代谢物种类、产物类似物、毒素和能降解产物的酶类等； （2）原材料和培养基的来源及其质量； 分离纯化的技术 一、分离纯化技术要求 二、分离纯化的技术 1、细胞破碎与固液分离 2、目的产物的分离纯化 3、非蛋白质杂质的去除 三、常用分离方法的比较 分离纯化技术要求 （1）技术条件要温和，能保持目的产物的生物活性； （2）选择性要好，能从复杂的混合物中有效的地将目 的产物分离出来，达到较高纯化倍数； （3）收率要高； （4）两个技术之间要能直接衔接，不需要对物料加以处理或调整，这样可减少工艺步骤； （5）整个分离纯化过程要快，能够满足高生产率的要求。 第九节 基因工程药物的质量控制 一、原材料的质量控制 二、培养过程的质量控制 三、纯化工艺中的质量控制 四、目标产品的质量控制 五、产品的保存 第十节　基因工程药物制造实例 一、人干扰素的基因工程制备 二、人胰岛素融合蛋白重组菌株的组建（自学） 三、乙型肝炎表面抗原重组酵母的组建（自学） 四、基因工程在抗生素生产中的应用 五、基因工程在氨基酸和维生素生产中的应用 六、基因工程在生物制品制造中的应用 七、基因工程在新药研究中的应用 一、人干扰素的基因工程制备 一、概述 二、基因工程菌的构建 三、发酵 四、产物的提取和纯化 五、质量控制标准和要求 二、基因工程菌的组建 诱生的白细胞 四、产品的提取与纯化 超声破碎，离心，上清超滤浓缩，葡聚糖凝胶 分离，经SDS检查。 在经DE-52纤维柱纯 化。 五、质量控制标和要求 ⒈半成品检定 ⑴干扰素效价测定 ⑵蛋白质含量测定 ⑶比活性 ⑷纯