祁连圆柏对白血病HL-60细胞增殖的抑制作用及其有效部位筛选.pdfVIP

V01．20No．2 中国中医药科技2013年3月第20卷第2期M扎2013 ．135． 祁连圆柏对白血病HL．一60细胞增殖的 抑制作用及其有效部位筛选 王索安1 徐涛2 包金风3 仇容1 沈健1 陈健1 刘丹丹1 (1浙江医学高等专科学校·杭州310053 2浙江理工大学生命科学院·杭州3100003徐州医学院．徐州221000) 摘要 目的：探讨祁连圆柏对白血病HL一60细胞增殖的抑制作用并进行有效部位的筛选。方法：选 用硅胶柱层析法，提取有效的抗瘤组分。采用台盼蓝拒染法及M1-I显色法，检测不同浓度祁连圆柏提取 物作用不同时间后对HL一60细胞增殖的影响，光镜结合电镜观察凋亡细胞的形态特点，流式细胞术 (FcM)检测其诱导细胞凋亡的细胞周期阻滞点，免疫组化sP法对细胞周期蛋白P27及P16的表达水平 进行检测。结果：祁连圆柏各提取物对HL一60细胞增殖有明显的抑制作用，C液作用最明显，c液一3组 分作用显著。光镜与电镜下均见凋亡细胞明显增多。流式细胞术检测Go／Gl期细胞增多，G：／M期细胞 减少，细胞的半数抑制浓度(Ic50)为3．07彬IIll。实验组细胞周期蛋白P27及P16表达水平明显升高。 结论：祁连圆柏对白血病HL一60增殖有明显的抑制作用，其中醇提乙酸萃取物组分一3作用最为显著， 其作用机制与诱导细胞凋亡，改变细胞周期，上调P27、P16蛋白水平有关。 主题词祁连圆柏／药理学HL一60／药物作用体外研究 祁连圆柏(胁枷n岱∥髭砒触，．，P)系柏科植物，是常用回收溶剂得石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、 中藏药，既往体外研究资料表明，JP醇提物对人乳腺癌、肺 乙醇提取物、水煎乙酸乙酯提取物、水煎正丁醇提取物。取 癌、口腔上皮癌具有杀伤作用，但抗肿瘤机制不明¨】。本课 各提取物适量，用生理盐水配成所需浓度，脂溶物以二甲基 题组近期研究资料表明JP醇提浸膏对人胃癌sGC一7901细 胞有明显的增殖抑制和诱导凋亡作用】。本实验以体外培 菌，4℃保存备用。 养白血病HL一60细胞为研究对象，主要采用硅胶层析法进2．1．2细胞复苏和培养将冻存在离心管内的HL一60细 行药物筛选，观察不同浓度JP提出物c液一组分1，2，3，4， 胞用37℃水浴解冻，吸出细胞悬液，装入另一支离心管中， 5，6对HL一60细胞生长的抑制作用，并对其作用机制进行 初步探讨。 匀后离心(1000r／Inin，5分钟)。吸去冻存液。复苏细胞加入 l材料人白血病HL一60细胞株：由兰州军区总医院药含15％小牛血清的1640培养液充分混匀，使其浓度为2× 局实验室惠赠。RPMI一1640：sig眦公司产品，用前加双抗、 养。 青霉素(100U／m1)、链霉素(100峭／m1)；小牛血清：杭州四季 青生物工程公司产品，56℃水浴，一20℃保存；0．25％胰酶、2．1．3细胞传代倒置显微镜下观察培养瓶内细胞长满单 0．02％EDTA、H蚰l【s液、3．7％NaHc0，等试剂：自行配制；碘层后弃掉培养液，加入适量O．25％胰酶液(覆盖瓶底)，置 化丙啶(PI)：Si眇公司产品；凋亡相关基因蛋白(P27、P16)37。c环境中消化1～2分钟。加入适量的H卸k’s液轻洗1 过氧化物酶标记的链霉卵白素染色试剂盒：购自北京中山生 遍后加入含15％小牛血清的RPMl164JD液5“，吹打制成细 物技术有限公司。coudterepicsxL流式细胞仪：美国coulter胞悬液，按2×105个／Ⅱll浓度接种培养。 2．1．4细胞增殖抑制试验M1-r还原法。取培养细胞以2 公司；C02培养箱：NATuRE，USA；倒置相差显微镜：0lympus cl()(，Japan。祁连圆柏：青海大学医学院藏医系惠赠。 ×105个／rIIl的密度分别接种于96孔板，其中2孔只加RP． 2方法与结果