猪繁殖呼吸综合征病毒、猪圆环病毒Ⅱ型、猪伪狂犬病病毒SYBR+Green-Ⅰ实时荧光定量PCR方法及多重SYBR+Green-Ⅰ实时荧光PCR方法建立.pdfVIP

摘 要 and virus。 猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine respiratorysyndrome reproductive circovirus PRRSV)、猪圆环病毒II型(Porcine2，PCV．2)、猪伪狂犬病病毒 type (Porcinepseudorabiesvirus，PRV)是3种重要的猪传染病病原，流行病学调查表明， 上述3种病毒广泛存在于猪群当中，且常常混和感染猪群而引起发病。虽然针对 每一种病原的诊断方法已然广泛应用，但是常规的病原学、血清学诊断方法由于 其费时、费力等劣势已很难满足实际生产的需要，因此，建立一种省时、省力、 自动化程度且可以同时检测3种病原的方法就显得尤为重要。 实时荧光定量PCR是20世纪90年代发展起来的一种检测核酸分子的新技术，： SYBR Green．I作为一种非序列特异性的荧光染料被广泛地应用与荧光定量PCR中， 其原理是在PCR体系中加入SYBRGreen．I，通过荧光强度的变化，可以对PCR过程 进行实时监测，最后通过标准曲线可以对未知样品中的核酸分子进行准确定量分 Green．I的定量PCR 析，也可以通过溶解曲线对未知样品进行定性分析。基于SYBR 方法与其它类型的定量方法相比具有简便易行、成本低廉的优点，目前，该技术 已被广泛应用与生命科学研究的各个领域。本研究拟应用SYBRGreen．I实时荧光 PCR技术建立检测PRRSV、PCV．2、PRV的快速诊断方法。 本研究首先根据GenBank登录的PRRSVN蛋白基因、PCV-2 rep蛋白基因 和PRV gE基因的核酸序列设计三对特异引物，各病毒扩增片段长度为：PRRSV 81 1 1 bp、PCV．230bp、PRV30bp，将这3个基因的部分核酸序列进行克隆并测序， 然后将3种病毒的重组质粒测OD260，计算得出其浓度：拷贝／gL，并进行梯度稀 释，将其作为标准品分别建立3种病毒SYBRGreen．I实时荧光定量PCR方法， 0．998、 建立的3种病毒的实时荧光定量PCR方法相关系数(R2)分别为：PRRSV PCV．20．996、PRV0．983，扩增效率分别为：PRRSV1．0l、PCV-20．92、PRV0．98。 表明，3种病毒定量PCR方法的检测敏感性可达：PRRSV 50 25拷贝／gL、PCV．2 拷贝／gL、PRV50拷贝／gL。3种病毒3个浓度的标准品重复性试验表明， 5％、2．1 PRRSV(1 2％、2．45％， OO、50、25拷贝／rtL)批内重复性试验变异系数分别为1．1 000、1 批间重复性试验变异系数分别为2．59％、2．23％、2．63％；PCV．2(100、50拷 9％、2．1 000、l 数分别为4．44％、2．1 4％：PRV(1 00、50拷贝／gL)批内重复性变异系 3．94％。实验结果表明，3种病毒的SYBR