多肽导向技术及应用.docVIP

第 章 多肽导向技术及其应用 秦鑫 张英起 一、多肽导向技术的概念和由来 生物技术的快速发展大大促进了新药发现与设计的速度，但是体内用药时，如何使药物特异性地到达病灶部位仍然是限制许多药物由实验室走向临床的一大难题。药物在其它组织或器官的非特异性分布，不仅增大了体内用药的剂量，使得药物成本提高；而且有可能损伤正常的组织或器官，引发毒副作用，这种毒副作用有时甚至是致死的。为了克服这一难题，人们提出了导向性的治疗策略，该策略的理论基础是相对于正常的组织，病灶部位（特别是肿瘤）具有自己独特的表面分子，这些分子不仅是相对特异的而且常常是高表达的，所以若给药物连接上这些分子的配体或抗体，则借助于这些配体或抗体和它们相应的分子的结合，药物便可特异性的被带到病灶部位。该策略被认为是提高药物特异性的有效方法。目前导向性药物的开发在药物开发领域发展处于邻先地位，仅以美国为例，其导向性药物的开发以13.2%的年增长率位居全美药物市场的首位。 最初作为导向性分子的为抗体，如转铁蛋白抗体，抗HER2抗体等与药物连接后都大大提高了药物在病灶组织的富集。但是抗体由于分子量大在作为导向性分子时有一些缺点，如易引发机体的免疫反应，渗透性差等，由此人们更倾向于利用小分子肽作为导向性分子。可以作为导向性分子的肽包括量大类，一类是天然存在的肽，如生长激素释放抑制因子（somatostatin）、血管活性肠肽（vasoactive intestinal peptide, VIP）等，它们分别在神经内分泌肿瘤、消化道癌等的特异性诊断和治疗方面发挥了良好的导向性作用。另一类则是非天然存在的肽，与天然肽相比，该类肽的种类更多，鉴定更方便，而且有可能比天然肽与其相应受体的亲和力更高，故该类肽成为近年来人们关注的热点。噬菌体呈现技术则被认为是用于筛选该类肽的快速而有效的方法。本文将着重对以噬菌体呈现肽库来源的肽为导向分子的导向技术进行论述。 二、噬菌体呈现多肽库的构建 噬菌体呈现技术起源于Smith在1985年报道的将外源多肽在单链噬菌体表面呈现的结果，其原理是将编码外源多肽或蛋白的基因片断插入噬菌体衣壳蛋白的基因中，从而将外源多肽或蛋白呈现于噬菌体表面。由于构成外源基因片段的脱氧核苷酸可以随机的排列组合，所以可以构建呈现不同外源多肽或蛋白的噬菌体表面呈现多肽或蛋白库，进而应用于酶底物的筛选，抗体的筛选，配体的筛选，蛋白间相互作用的研究，疾病的诊断等方面。近几年来，该技术迅速发展，已成为生物学研究和应用领域中有效而重要的工具。 （一）用于噬菌体呈现技术的载体 可用于噬菌体表面呈现的载体很多，如T4噬菌体、λ噬菌体及丝状噬菌体等。与丝状噬菌体相比，T4噬菌体和λ噬菌体作为呈现载体有一些优点：第一两者均为烈性噬菌体，它们通过裂解宿主菌得以释放，这样一些难以穿过细菌细胞膜的蛋白，如球状蛋白、疏水性的蛋白等就可以呈现在噬菌体表面，而丝状噬菌体呈现的蛋白必须是一些能够穿越细菌细胞膜的蛋白，因为对于丝状噬菌体而言，其衣壳蛋白的组装是在细菌的质周腔中完成的，被呈现在衣壳蛋白上的外源蛋白必需要穿越细菌的细胞膜到达质周腔。第二，T4噬菌体和λ噬菌体可以用于呈现高拷贝的外源蛋白，而且对外源蛋白大小的限制较小。第三，T4噬菌体和λ噬菌体可以比较方便的用于外源蛋白的C-端呈现。目前T4噬菌体和λ噬菌体呈现系统发展很快，但是丝状噬菌体呈现系统依然是构建肽库的首选载体，这是因为首先由于T4噬菌体和λ噬菌体呈现的蛋白是在细菌的细胞内完成的，而细胞内还原性的环境无法形成二硫键，呈现的外源蛋白全部是缺少二硫键的，这样就提高了蛋白错误折叠的可能。而如前所述，丝状噬菌体呈现外源蛋白的组装是在质周腔中完成的，质周腔中氧化性的环境为二硫键的形成提供了条件，从而保证了外源蛋白折叠的准确性。第二，T4噬菌体和λ噬菌体的基因组大，比较复杂，操作比较麻烦，而丝状噬菌体的基因组较小，操作起来很方便。第三，T4噬菌体和λ噬菌体呈现系统必须进行DNA的亚克隆才能在蛋白水平上进行分析。正是由于这些原因，丝状噬菌体呈现系统仍然是目前最常用，发展最快的呈现系统。 （二）丝状噬菌体呈现系统的特点 丝状噬菌体是一类具有丝杆状形态的噬菌体，在分类中属于丝杆噬菌体科(Inoviride),丝状噬菌体属(Inovirus)。用于表面呈现的噬菌体为一类特异性感染大肠杆菌的噬菌体，包括M13、fd、f1、If1和Ike等。它们具有相似的结构。以M13噬菌体为例，它的核心为6000bp的环状单链DNA，含10个基因，分别编码10种不同的蛋白。其中基因VIII编码主要衣壳蛋白pVIII, 基因III,VI,VII,IX分别编码次要衣壳蛋白pIII、pVI、pVII、pIX。M13噬菌体以其次要衣壳蛋白pIII仅感染具F纤毛的大肠杆菌。 丝状噬