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实验一 人类体细胞染色体标本制备与核型分析 Metaphase Chromosome Preparation and Analysis of Karyotype 【实验目的】 熟悉人类外周血淋巴细胞的培养方法及染色体标本的制备方法。 熟悉人类染色体G显带标本制备与分析。 【实验原理】 染色体是在显微镜下可见细胞有丝分裂过程中出现的结构。因此，必须获得染色体标本才能进行检查分析，通常情况下，都是利用外周血淋巴细胞进行核型分析。正常情况下，人体外周血淋巴细胞不再分裂，但植物血凝素（PHA）可刺激血中的淋巴细胞转化成淋巴母细胞，使其恢复增殖能力。因此，可采取少量外周静脉血，做短期培养，培养至72小时细胞进入增殖旺盛期，此时加入秋水仙素抑制细胞分裂，使细胞分裂停止在中期以获得足够量的分裂期细胞，经低渗、固定、制片、染色后镜下观察进行核型分析。上述制备的染色体标本经胰蛋白酶消化、Giemsa染色后，可在染色体纵轴上显示出着色深、浅相间的横纹——带，表明每条染色体的特征。 【实验用品】 1．采血器材、酒精灯、培养瓶、超净工作台、恒温培养箱、恒温水浴箱、离心机、刻度离心管、乳头吸管、试管架、量筒、试剂瓶、载玻片、吹风机、托盘天平、显微镜、镜油、二甲苯、擦镜纸、镊子、烧杯、记号笔、玻片架、火柴、10ml注射器。 2．RPMI 1640液体培养基、小牛血清、肝素（500 U/ml）、植物血凝素（PHA）、秋水仙素（10mg/ml）、KCl低渗液（0.075mol/L）、甲醇、冰乙酸、Giemsa原液、磷酸缓冲液（PH6.8）。 3．2.5％胰酶溶液（Hanks液配制）、0.4％酚红、Giemsa染色液、1N盐酸、1N氢氧化钠。 【实验步骤】 一．外周血淋巴细胞染色体标本制备与分析 1. 采血及接种培养 1.1 在酒精灯火焰上，用灭菌注射器（一次性注射器）抽取肝素0.2ml，使肝素湿润至管壁。 1.2 常规消毒后，采集外周静脉血5ml，转动注射器使血液与肝素混匀。 1.3 在超净工作台中，预先将RPMI 1640液体培养基（5ml，含植物血凝素60mg/ml、10%小牛血清）加入消毒好的小培养瓶中，再滴加25滴全血（6号针头），水平摇动混匀。 1.4 置37℃恒温培养箱中培养72小时。培养过程中每天水平摇动培养物1～2次，使血液均匀悬浮，再继续培养。 1.5 终止培养前2～4小时，加入秋水仙素，使终浓度达到0.2μg/ml。轻轻摇动培养瓶，使秋水仙素混匀。继续培养至72小时。 2．制片 2.1 收集细胞时，去掉瓶塞，用乳头吸管吸取培养液，充分混匀培养物，再将全部培养物吸入刻度离心管中。 2.2 1000 rpm离心8分钟（注意先配平）。 2.3 弃上清液，加入37℃预温的 0.075 mol/L KCl溶液8 ml，用吸管轻轻吹打细胞团混匀后，置37℃恒温水浴箱低渗处理25分钟。 2.4 加入 1ml新配制的固定剂（甲醇：冰乙酸=3：1），用吸管小心吹打、混匀，1000rpm离心8分钟。 2.5 弃上清液，加入8ml固定剂，吹打细胞团制成细胞悬液后，室温下固定20分钟。 2.6 1000 rpm离心 8分钟。 2.7 弃上清液，重复固定一次。 2.8 弃上清液，根据细胞数量的多少适当加入数滴新配制的固定剂，吹打细胞制成悬液。 2.9 吸取少量细胞悬液，滴2～3滴于冰水浸泡过的载玻片上，吹散，气干。 2.10 将标本置Giemsa染液中，染色8分钟，水洗去浮色，气干。 2.11 显微镜下观察染色体标本分裂相的多少及分散情况。 二．人外周血淋巴细胞染色体G显带标本制备与分析 1. G显带染色体标本制备 1.1 常规制片后，将标本置70℃烤箱中干烤2小时，自然冷却。 1.2 取2.5％胰酶溶液5ml，加入染色缸中，加入45 ml生理盐水，用 1N HCl或1N NaOH及酚红调节胰酶溶液成紫红色（PH6.8～7.2），置 37OC预温。 1.3 将玻片标本放入胰酶溶液中处理25～45秒钟，不断轻轻摇动玻片，使胰酶作用均匀。随着处理标本数量增加，胰酶逐渐消耗，胰酶作用时间逐渐延长。 1.4 取出染色体玻片标本，置于37℃预温的生理盐水中，然后用蒸馏水冲洗玻片（或轻甩，除去多余的胰酶）。 1.5 将玻片标本放入37℃预温的Giemsa染液中，染色5～10分钟。 1.6 自来水冲洗，气干。 1.7 显微镜观察。 【实验结果与分析】 一. 常规染色体核型分析 1．根据染色体的形态、大小及着丝粒的位置，将染色体分为七组。 A组染色体：包括1～3号染色体。长度最长，1号和3号染色体为中央着丝粒，2号染色体为亚中央着丝粒染色体。 B组染色体：包括4～5号染色体，长度次于A组；亚中央着丝粒染色体，短臂较短。 C组染色体：