谈携带Ubc9基因的病毒表达载体的构建及其在细胞中的表达.pdfVIP

摘 要 背景与目的：细胞内存在多种蛋白质共价修饰方式，如乙酰化、磷酸化、泛素化、 甲基化等，它们对蛋白质发挥正常的生物学功能起着重要作用。近些年来几种小 的类泛素蛋白(ubiquitin．1ikeproteins，Ubls)接连被发现，它们与泛素在二级结构 上极其相似，且催化修饰过程的酶体系也具有很高的同源性，SUMO(small modifier)就是其中的重要成员之一。SUMO不像泛素化与底物结 ubiquitin．related SUMO化修饰调节多种生物学的过程，包括核质转运，转录活性调解，DNA修 复和复制，以及有丝分裂和减数分裂时染色体的行为。研究发现能被SUMO被 其修饰的蛋白有百余种，例如RanGAPl，PML，IkB Q，c．Jun和p53等。SUMO 的生物过程至关重要。本研究构建含Ubc9基因的病毒表达载体，转染包装细胞 后使其产生病毒，收集病毒感染靶细胞，使细胞中的Ubc9基因过表达，以便于 深入研究Ubc9基因对细胞的作用。 方法：方法一：聚合酶链反应(PCR)扩增获取目的基因Ubc9，定向插入逆转录 染逆转录病毒包装细胞PT67；G418筛选产毒细胞克隆，扩大培养产毒细胞克隆， 收获病毒感染BMSC细胞。用Westernblot方法检测Ubc9在BMSC细胞中的表达。 方法二：把Ubc9基因定向插入腺病毒表达载体。pemI酶切将穿梭质粒 毒质粒经脂质体转染HEK293细胞，进行重组腺病毒的包装和扩增。收集重组腺 病毒，感染HeLa，用Westernblot方法检测Ubc9在HeLa细胞中的表达。 结果：结果一：限制性酶切和测序鉴定证实Ubc9正确插入逆转录病毒表达载体。 G418筛选获得稳定产毒的抗性细胞克隆，收获病毒能有效感染BMSC细胞。 结果二：通过PacI酶切证实携带Ubc9基因的腺病毒载体构建成功，包 装出携带Ubc9基因的腺病毒能有效感染HeLa细胞。 结论：携带Ubc9基因的病毒表达载体构建成功，转染包装细胞后能包装出病毒 颗粒，收集的病毒能有效感染靶细胞。用Westernblot方法检测Ubc9在靶细 胞中可高表达。 硕士研究生：李薇(细胞生物学) 导 师：刘晓萍(教授) 关键词：Ubc9基因；逆转录病毒；PT67细胞：腺病毒；293细胞 Abstract covalentmodificationof Background0bjective：Severalproteins，such嬲 in role function phosphorylation，acetylation，andmethylation,playimportantbiology of some were have protein．Recentyears ubiquitin—like proteins found，they similar structure、^，itlland remarkablysecondary ubiquitintheycovalentlyconjugate toother inthesimilar like small proteins multistepprocessubiquitination．The asthe members．