Ca2%2b%2fCaM%2fCav1.2%2fCaMKⅡ信号通路在阿尔茨海默病和血管性痴呆模型中的变化与研究.pdfVIP

·中文论著摘要· 默病和血管性痴呆模型中的变化研究 刖 置 老年性痴呆在临床上主要表现为学习和记忆能力的下降，它主要包括两种最 常见的疾病，即阿尔茨海默病和血管性痴呆。其中阿尔茨海默病发病率最高，主 要的病理变化是脑内Ap增多和神经缠结形成，而血管性痴呆主要是由于大脑的 血管和血流异常而引发。 目前关于痴呆的确切机制还不清楚，大量的研究支持钙离子浓度的改变在阿 尔茨海默病和血管性痴呆中起到了关键作用。电压依赖的钙离子通道在神经的生 长以及突触重塑方面发挥了非常重要的作用，其中L广型钙离子通道(LTCC)在 大脑中占80％，与神经的生长和死亡的关系最为密切。通过LTCC进入神经细胞 的钙离子能够有效的激活CREB以及CREB介导的基因转录。 的生长发育密切相关，钙离子与CaM形成的复合物Ca2+／CaM能够调节神经细胞的 许多蛋白，其中包括钙调蛋白激酶II、Carl．2等。 钙调蛋白激酶II(CaMKII)是一种钙离子激活的酶，这种酶在脑组织中的含量 高达1-2％，它作为一个兴奋转录偶联的介导因子在学习和记忆功能方面作用很 大。被复合物Ca2+／CaM激活后参与神经突触的重塑、学习记忆增强等。CaMKII 化作用。 脑源性神经生长因子(BDNF)在脑的发育、分化、突触重塑等方面发挥了 重要作用，在阿尔茨海默病的早期就有BDNF含量下降，它的转录受到CREB的 调节，所以CREB／BDNF信号通路参与调控大脑学习记忆功能。 多奈哌齐是胆碱酯酶抑制剂，临床上主要应用于阿尔茨海默病人，改善患者 的学习记忆能力，还有文献报道多奈哌齐的预处理可以减少局灶性脑缺血的梗死 面积，对谷氨酸的兴奋毒性也有保护作用。这些证据表明多奈哌齐对脑组织有保 护作用，但是对全脑缺血引起的学习记忆能下降的改善作用未见报道，所以本实 验对全脑缺血致沙鼠认知能力下降给予多奈哌齐进行治疗，并进一步探讨多奈哌 齐的改善作用是否与CaMKII／CREB信号通路相关。 本实验选用了国际公认的APP／PSl转基因小鼠做为阿尔茨海默病的研究模 型，同时也在细胞水平进行了研究，选用的细胞模型为Aplm诱导海马神经元损 伤模型。血管性痴呆模型我们选用先天脑Willis环缺失的蒙古沙土鼠，利用双侧 颈动脉暂短闭塞造成脑组织缺血，再用行为学检测学习记忆能力，学习记忆能力 下降的即为血管性痴呆模型。到目前为止，在APP／PSl小鼠及Apl-42诱导海马神 的表达变化以及分布变化未见系统的阐述，我们认为在这些模型中这几个蛋白参 与了学习记忆的减退。所以本实验主要研究在这些模型中Cavl．2、CaM、CaMKII、 CREB和BDNF蛋白表达的变化以及其相互关系的变化。 实验材料和方法 ‘ 一、材料 动物、试剂与仪器：健康APP／PSl转基因小鼠和C5781／6小鼠，9月龄，每 个实验组均为8只；Wistar新生鼠若干只，均为出生一天；蒙古沙土鼠，70—809， 雄性。均由中国医科大学实验动物部提供。鼠抗CaM(Santa Cruz)，鼠抗Carl．2 (Abeam)，兔抗CaMKII(SantaCruz)，兔抗p-CaMKII(SantaCruz)，兔抗p-CREB (Abeam)，兔抗CREB(SAB)，兔抗BDNF(SantaCruz)，13-actin(SantaCruz)；增强型 UV 多奈哌齐(同本卫材)；CMl900 LEICA冰冻切片机(德国)，电泳仪(Bio．Rad)， 共聚焦显微镜(Nikon)。 二、方法 2 (一)原代神经细胞的体外培养 出生l天的乳鼠取出大脑，分离出海马组织，然后用0．125％的胰酶消化5-8 分钟，加入15％胎牛血清终止消化，吹散细胞，将细胞种植在瓶皿中，第二天将 天进行实验。 (二)原代神经细胞MTT实验 将培养9天的神经细胞培养液换成无酚红的DMEM培养基，加入不同浓度的 DMSO溶解结晶颗粒，在570nm波长下检测光密度值。 1509L (三)神经细胞内钙的检测