人骨髓间充质干细胞分离培养、多向分化与鉴定.pdfVIP

人骨髓间充质干细胞的分离培养、多向分化与鉴定1 戴文达，方涛林，李熙雷，林红，董 健，陈峥嵘 复旦大学附属中山医院骨科，复旦大学上海医学院外科学系，上海 （200032） Email ：dong.jian@ 摘要: 目的 探索一个高效分离和扩增人骨髓间充质干细胞的方法，并通过形态学和多向分 化能力进行鉴定。方法 抽取人胸椎骨髓标本，联合利用密度梯度离心和差异贴壁法分离 MSCs，体外扩增后传代，相差显微镜形态学观察和流式细胞仪检测细胞表面标记 CD13、CD29、 HLA-2、CD34、CD45和 HLA-DR。在地塞米松、左旋 VitC、β-磷酸甘油、FK506作用下向成骨 细胞诱导分化；在 TGF-beta 3、重组人胰岛素、丙酮酸钠、亚硒酸等作用下向软骨细胞诱 导分化；在地塞米松、IBMX、吲哚美辛的作用下向脂肪细胞诱导分化；在 VEGF、bFGF 作用 下向血管内皮细胞分化。结果 原代和传代细胞呈梭形外观，生长增殖能力良好。细胞表面 标记物 CD13、CD29，HLA-2阳性，CD34、CD45 和 HLA-DR阴性。经定向诱导分化后，细胞分 别呈现成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和血管内皮细胞的表型特征。结论 该方法能从人骨 髓中高效分离和扩增 MSCs，能成功定向分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和血管内皮 细胞。 关键词:骨髓间充质干细胞；细胞培养；细胞分化；组织工程 中图分类号: Q813 1 本课题得到 973 项目（骨骼、周围神经损伤修复机制与措施和重度脑创伤救治研究，2005CB522600 ），教 育部博士点基金（HIF-1 α/VP16 嵌合基因转染促进大块人工骨中心区域的微血管化，20060246074 ）资助 - 1 - 1．引言 干细胞是目前生命科学的研究热点。骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Derived Mesenchymal Stem Cells，MSCs）因其自身所具有的特殊性而日益受到人们的关注。MSCs 最早由Friedenstein发现，具有多向分化潜能，在特定的条件下可分化为成骨细胞、成软骨 细胞、脂肪细胞、血管内皮细胞、肌肉细胞、神经细胞等多种中胚叶来源组织细胞 [1-3] ；而 且MSCs特性稳定，易于获得及扩增，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能 [4] 。在 组织工程中具有良好的应用前景。人体骨髓中MSCs含量稀少，仅占单个核细胞的百万分之一 到十万分之一。而组织工程需要大量的种子细胞，故需进行体外纯化和扩增。本实验研究人 MSCs的体外分离、纯化、扩增以及定向分化条件，为MSCs的临床应用提供理论依据和技术方 法。 2．材料和方法 2.1主要试剂和仪器 -3 低糖DMEM培养基(Gibco, USA)，优等胎牛血清(Hyclone, USA)，Percoll（1.073×10 g/L, Sigma, USA），青霉素G钠，硫酸链霉素，两性霉素B（GIBCOBRL, Life Technologies, USA）， 地塞米松，β-甘油磷酸，左旋维生素C（Sigma, USA），FK506 (Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd, Japan)，丙酮酸钠（Sigma, USA），TGF-beta 3（RD Systems, Inc. USA），重 组人胰岛素（优沁林®常规，中国礼来公司），转铁蛋白，亚硒酸，牛血清白蛋白，亚油酸 （Sigma, USA），IBMX（1-甲基3-异丁基-黄嘌呤）（Biosource, USA），吲哚美辛（Cayman Chemical, USA），油红O（Sigma, USA），抗CD29、CD44、CD34 及CD45单克隆抗体(Sigma)， VEGF，bFGF，Ⅰ、Ⅱ型胶原抗体（SIGMA, USA），生物素化二