FCM原理-研究生.ppt

* * * * 有剪碎法、网搓法、研磨法等 它是利用机械方法，物理方法给予组织 较大的压力或用超声振荡使细胞从组织间 分散开来。 ２. 机械法： 贴壁粘连作用钙镁离子结合掉，从而使细胞分散。常用试剂有EDTA、EGTA、TPB等。 ３. 化学试剂处理法： EDTA是一种螯合剂。实际运用时采用 螯合剂加酶学法（主要是采用胰蛋白酶）。 这样的分散细胞方法效果要比单独采用化 学试剂法好。 其他常用的化学试剂还有Triton-x-100， 四苯硼等。 机械法往往常成严重的细胞损伤，而结果却是较低的细胞产量。 如用低速离心去碎片，用尼龙网过滤团块等， 也可利用电子学技术处理的方法排除团块和碎片 的干扰。 酶学法、化学法对实体组织的分散效果较理想，但会造成所测化学成份的不良影响。FCM所测细胞是单个分散状态；对细胞团块，细胞碎片尽可能 少；细胞的活性不受损害，以保证下一步的荧光 染色处理不受影响。 小结 检测石腊包埋组织，对细胞成份及特性 进行定量定性分析是近年来流式细胞术在临 床肿瘤学的应用和基础生物学的应用，因此， 石腊包埋组织单细胞悬液制备技术的建立使 大量存档的临床资料重新得到研究与利用， 从而扩大了流式细胞术的应用范围。 （二）石腊包埋组织单细胞悬液的制备 常用的方法有以下几种： １.利用细胞之间密度或体积的差异分离 ２.利用细胞的吸咐力特性分离 ３.利用单克隆抗体分离细胞亚群 ４.利用选择性破坏和保留一部分细胞亚群 ５.利用FCM分析技术区分细胞亚群 ６.利用流式细胞分选术分选细胞亚群 二、选择性分离细胞亚群 （1）自然沉降法 （2）密度梯度离心法，电泳法，离心鼓淘汰法。 用淋巴细胞分离液根据各细胞亚群的比重不 同可以分离出淋巴细胞、粒细胞等。 １.利用细胞之间密度或体积的差异分离 （1）玻璃和磁铁吸咐法：纯化淋巴胞 （2）花环沉降法：T、B淋巴细胞的化 （3）吸咐法：纯化单核细胞 ２.利用细胞的吸咐力特性分离 ３.利用单克隆抗体分离细胞亚群 阳性选择 阴性选择 MACS-Magnetic Cell Sorting 磁珠分离 氯化铵选择性破坏红细胞 ４.利用选择性破坏和保留一部分细胞亚群 用散射光信号 区分淋巴、 粒、单核细胞 ５.利用FCM分析技术区分细胞亚群 干细胞（CD34+）的分选 ６.利用流式细胞分选术分选细胞亚群 488 nm laser + - Charged Plates Single cells sorted into test tubes FALS Sensor Fluorescence detector 分离结果的验证指标有两方面： 收获率和纯度 收获率 是指分离后所得的细胞亚群数 占原细胞样品中该亚群细胞数的百分比。 纯度 是指分离后的样品中该亚群细胞 所占的百分比。 小结 三、细胞荧光染色技术 流式细胞术快速分析单细胞的各种生物学 特性和各种生化成份并定量测定这些参数是 通过荧光细胞化学方法实现的。 （一）细胞化学的定义和原则 （二）细胞悬液中荧光细胞化学方法的特点 （三）荧光细胞化学的评价标准 （四）FCM荧光细胞化学的分类 （五）细胞DNA荧光染色 （六）细胞RNA荧光染色 （七）细胞蛋白质荧光染色 （八）其它荧光染色方法 三、细胞荧光染色技术 １. 荧光细胞化学过程的特异性 FCM的荧光细胞化学过程要求有足够的 特异性，荧光染料与细胞成分是否为特异 性结合。严格控制各种反应条件是保证反 应特异性的重要因素。 （三）荧光细胞化学的评价标准 ２. 荧光细胞化学的化学定量关系 在相同的条件下，荧光反应产物（荧光强度）与所研究的生化成份的含量或活性之间有严格的化学定量关系。 荧光染色定量关系 荧光染色的特异性 1. 共价结合的反应过程 Feulgen反应，FITC与蛋白质分子中的 自由氨基形成的硫碳氨基键等。 2. 插入性结合方式的反应过程 EB，PI，7-氨基放线菌素D( 7-AAD )等。 结合紧密、稳定，染料不会丢失脱落， 简便，特异性较高，被广泛应用。 3. 结构亲合方式的反应过程 吖啶橙与核酸单链结合，派若宁Y与单 链核酸结合等。反应过程易受溶液pH的 影响。结合极弱,易丢失。 （四）FCM荧光细胞化学的分类 表1-2 常用荧光探针的光谱特性 分类 染料 激发谱 发射谱 FITC 紫 蓝 绿 TRITC