RT-PCR为基础的T-RFLP应用于乳品发酵中新陈代谢活性细菌的半定量分析._百替生物.docVIP

RT-PCR为基础的T-RFLP应用于乳品发酵中新陈代谢活性细菌的半定量分析 Jorge I. Sa′nchez a, Lia Rossetti b, Beatriz Mart?′nez a, Ana Rodr?′guez a, Giorgio Giraffa b,* a Instituto de Productos La′cteos de Asturias (IPLA-CSIC), ctra. Infiesto, s/n, 33300 Villaviciosa, Asturias, Spain b Istituto Sperimentale Lattiero Caseario, via A. Lombardo 11, 26900 Lodi, Italy Received 2 February 2005; received in revised form 21 July 2005; accepted 28 July 2005 Available online 21 September 2005 （杨明翻译） 摘要：一种包括RT-PCR扩增全部微生物群落的16S rRNA和T-RFLP的方法，对于在确定的乳酸乳球菌乳酸亚种和柠檬明串珠菌菌株培养中半定量的描述新陈代谢活性数量是最优的，这是两种在奶酪生产中被通常使用的嗜温的乳酸菌种。选择好的PCR引物高效地扩增这两个菌种的16S rRNA。用DdeI消化PCR产物生产每种菌种的不同的末端限制性酶切片段（T-RFs）。然而，由于嵌合分子的形成和来源于部分单链16S rRNA的扩增子的假T-RFs产生的额外的T-RFs在两个菌种中都被观察到了，尽管是很少量的。为了避免过量PCR产物对定量DNA产生的饱和效果导致的对总量的低估和尽量减少假片段的出现，20个PCR循环是最佳的。当应用于混合乳品培养时，T-RFLP分析表现出很好的可重复性。用这种方法和结果研究包括乳酸乳球菌乳酸亚种菌株和柠檬明串珠菌菌株的两种混合初始物的动力学，并和用纯培养获得的做对比。这些数据显示了用T-RFLP进行半定量微生物数量分析的适宜性。某些微小的差别可以用菌落计数不能被检测到的新陈代谢活性细胞的出现来解释。以RT-PCR为基础的T-RFLP可以作为传统方法之外的另外一种选择，用于研究相对简单的微生物（比如确定乳品起始物的培养物）生态系统的新陈代谢活性的群体动力学。 关键词：乳品初始物；RT-PCR；半定量；T-RFLP 1．前言 几种奶酪生产中常用的初始培养物通常包括成酸性的乳球菌，和一些通常属于乳酸乳球菌乳酸亚种、二丁酮链球菌和明串珠菌属某些种的利用柠檬酸盐的菌株。这些培养菌对于器官感觉的特征的发展是非常重要的（Ca′rcoba et al., 2000.）。确定的菌株的初始物已经被奶酪制造商日益增多地采用，作为一种尝试来解决与未受控制的自然发酵相关的问题。这对于奶酪的质量有积极的效果。因为整个发酵过程中菌株的平衡是一个关键点，所以需要监控任何对细菌群落结构的暂时影响，这些影响可能改变想得到的奶酪的特性的正确过程。（Giraffa, 2004） 培养作为一种评价食品中微生物群落多样性和动力学的方法已经有几十年了。以培养为基础的方法被长期接受并获得普遍成功，但是这些技术费时费力，而且在某些情况下不一定能提供微生物群落组成的可靠信息。未知的和不可培养的种的出现以及样本的混合和稀释步骤会对微生物的生存能力产生影响，能够导致对产品真实生态学组成的失真的观察（Fleet，1999）。 而且，在不利条件下，比如营养耗尽、低温和其他压力，某些微生物能进入可生存的但不可培养（VNC）的状态。VNC 状态的微生物仍然具有新陈代谢活性但是不能在通常支持它们生长的培养基上形成菌落，因此它们不能被传统的方法发现。为了克服这些问题，免培养法比如变性梯度凝胶电泳/温度梯度凝胶电泳（DGGE/TGGE）、单链构象多态性（SSCP）、荧光原位杂交（FISH），或者以 PCR 为基础的技术比如长度异质 PCR（LH-PCR） 和末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）在过去几年得到发展（Giraffa and Neviani,2001）。T-RFLP 是一种分析不同细菌的16s rRNA 的差异，并提供微生物种群结构信息的方法（Osborn et al.,2000）。它是以限制性核酸内切酶消化荧光末端标记的PCR产物为基础的。单独的末端限制性酶切片段（T-RFs）被电泳分开并由荧光信号亮度量化。依靠微生物群落的物种组成，获得明显的外形（T-RF图案），一种代表一个物种的存在。一个相对定量的分布可以获得，因为每个顶点的荧光密度是和混合物中每个物种的 DNA 量成比例的。然而，PCR 的偏差可能对微生物群落真实组成的量化产生消极的影响（Suzuki