真菌发酵法产油脂的研究.docVIP

真菌发酵法产油脂的研究微生物油脂又称为单细胞油脂，是一种潜在的可应用于工业化的新型油脂资源[1]，其油脂中含有特殊的多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs)成分，主要是指γ-亚麻酸(GLA)、α-亚麻酸(ALA)、花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA)及二十碳六烯酸(DHA)等。这些多不饱和脂肪酸具有重要的保健功能，已被证实的生理功能有：防治高血压、心脏病，其中有些是大脑和神经系统重要的、不可缺少的营养物质，经过一段时间的食用后可明显提高记忆力和改善睡眠效果；对儿童组的试验则表明这些多不饱和脂肪酸可明显提高儿童智商[2]。多不饱和脂肪酸通常来源于动、植物资源，然而由于种种限制，人们把寻求PUFA的目光转向了微生物资源。利用低等丝状真菌发酵生产PUFA已成为当前国际上发展的趋势[3]。用微生物发酵法生产PUFA，不受原材料和气候限制，生产周期短，工艺简单，成本较低，可以集约化大规模生产，产物含量高，分离提取容易，且油脂成分更接近母乳，营养学上独具特色，因而引起了国内外研究人员的广泛关注。目前利用微生物生产油脂的主要问题之一就是廉价培养基的选择。培养基质是发酵的基础，而其中碳源的用量相对较多，因此，碳源的选择对发酵成本的影响至关重要。目前的研究主要集中在葡萄糖作为发酵的碳源[4]。然而，葡萄糖是价格较贵的原料，从而降低了生产的经济可行性和竞争性。本文研究不同碳源及氮源对被孢霉菌发酵产油脂的影响，旨在初步筛选出适合的廉价的培养基质，并探讨利用玉米淀粉水解糖作为发酵培养基的碳源的可行性，研究微生物油脂的工业化生产的可行性。 1材料与方法 1.1材料深黄被孢霉As3.2793??? 中国科学院微生物研究所菌种保藏中心。α-淀粉酶、糖化酶(活力为50000U/g)??? 无锡杰能科生物工程有限公司；酒石酸钾钠、丙三醇、葡萄糖、酵母膏等均为分析纯。 1.2方法 1.2.1培养基斜面培养基(g/L)：20%土豆汁，葡萄糖20，琼脂15，121℃，20min灭菌。种子培养基(g/L)：20%土豆汁，葡萄糖20，磷酸二氢钾3，硫酸镁1.5，pH6，121℃，20min灭菌。基本发酵产脂培养基(g/L)：20%土豆汁，葡萄糖100，磷酸二氢钾3，硫酸镁1.5，维生素B1微量，pH6，121℃，20min灭菌。 1.2.2培养方法菌种接种于斜面培养基，28℃培养3d。无菌水洗下孢子，接种于种子培养基，100ml三角瓶装液10ml，28℃ 140r/min，培养48h。种子液10%(V/V)接种于发酵产脂培养基，500ml三角瓶装液100ml，28℃ 140r/min，培养7d。 1.2.3发酵产脂培养基的优化固定基本发酵培养基的其他成分，改变碳源和氮源。按1.2.2的培养方法进行发酵产脂培养，进行发酵产脂培养基的优化。1.2.3.1碳源的优化(1)玉米淀粉水解糖的制备玉米淀粉调浆→加入α-淀粉酶用量的一半，50℃保温5min→升温至70℃，加入余量的酶→恒温反应至液化结束，测定DE值→100℃/20min灭酶→调pH4.5→60℃加入糖化酶→恒温反应至糖化结束→100℃/20min灭酶[5] 按上述工艺流程制取玉米淀粉水解糖。由前期预试验确定的工艺参数为：35%淀粉乳在70℃，α-淀粉酶添加量为7.5U/g条件下液化17.5min，此条件下液化液的DE值为15.96%；液化后调pH4.5，降温到60℃，添加100U/g糖化酶，糖化24h，获得糖化液的DE值为95.3%。试验中α-淀粉酶、糖化酶活力的测定采用QB/T1803－1993[6]；DE值的测定采用斐林滴定法测定[5]；固形物含量的测定采用阿贝折光仪。(2)碳源种类及其浓度的确定固定100g/L的糖浓度，分别以玉米淀粉水解糖、葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、乳糖、麦芽糖、D-核糖、半乳糖、海藻糖这9种常见碳源培养深黄被孢霉菌，进行发酵产脂试验。以菌体生物量、油脂含量及油脂产量作为评价指标，选出油脂产量高的作为最佳碳源。然后固定筛选出来的最佳碳源，改变其浓度(60、80、100、120、140g/L)，进行发酵产脂试验，确定其最佳添加浓度。 1.2.3.2氮源的优化选取上述试验确定的最佳碳源及其浓度，分别以酵母膏、蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵、尿素这5种氮源培养深黄被孢霉菌，氮源的添加浓度为3g/L，以菌体生物量、油脂含量及油脂产量作为评价指标，选出油脂产量高的作为最佳氮源。然后改变筛选出来的最佳氮源浓度(2、3、4、5、6、7、8g/L)培养深黄被孢霉菌，确定其最适添加浓度。1.2.4分析检测方法1.2.4.1发酵液残糖量的测定DNS比色法[7]。1.2.4.2菌体生物量(DW)的测定培养好的菌丝体，用布氏漏斗进行减压抽滤，并用蒸馏水反复冲洗3次，取湿