质粒DNA的提取、纯化与鉴定.docVIP

石河子大学 生物化学实验 姓名：侯云鹏 专业：作物遗传育种 学号：2013107014 学院：农学院 质粒DNA的提取、纯化与鉴定 侯云鹏 （石河子大学农学院，新疆 石河子 832000） 摘 要：采用碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA，然后对提取的质粒DNA进行琼脂糖凝胶电泳分析，并用凝胶电泳成像系统进行拍照、分析。结果表明碱裂解法提取的质粒DNA纯度和产量高，且重复性好，具有结果稳定的特点，达到了分子生物学的实验要求。 关键词：质粒DNA；碱裂解法；琼脂糖凝胶电泳 前言 质粒是一类存在于细菌染色体之外，能够独立复制并稳定遗传表达的双链环状DNA分子。大小从1Kb至200Kb以上不等，且携带抗生素、耐重金属等重要性状的筛选基因，以超螺旋状态存在于寄主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息，它可将有用的外源基因通过基因工程的手段送入细胞中繁殖和表达，是分子生物学实验中常用的工具。 质粒DNA这种基因运载工具在分子生物学中有着极为广泛的应用前景，而质粒DNA的提取、纯化与鉴定是分子生物学实验中经常使用的最基本的工作。质粒DNA的提取效率和纯度直接影响到分子生物学实验的成功与否，比如酶切、连接、大肠杆菌的转化、PCR扩增等。从细菌中分离质粒DNA的方法一般包括3个步骤：培养细菌，使质粒DNA大量扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。目前，分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构特点以及质粒DNA的用途进行选择。本实验采用碱裂解法提取质粒DNA，并用琼脂糖凝胶电泳分析。 1材料与方法 1.1实验材料 含有pUC19质粒的大肠杆菌 1.2实验仪器 恒温培养箱、恒温摇床、高速离心机、漩涡振荡器、超净工作台、高压灭菌锅、微量加样器、烧杯、量筒、玻璃杯、微波炉、天平、电泳梳子、电泳槽、电泳器、紫外灯、 1.3实验试剂 ①溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖、25mmol/L三羟基甲基氨基甲烷（Tris）Tris-HCL （pH8.0） 、10mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA） pH8.0、高压蒸汽灭菌20min后，4℃保存。 ②溶液Ⅱ：0.4mol/L NaOH、2%SDS（用时等体积混合，现配现用），注意：SDS易产生气泡，不要剧烈搅拌。 ③溶液Ⅲ：60mL 5mol/L KAc 、11.5ml冰醋酸、28.5mLH2O （该溶液钾离子浓度为3mol/L，醋酸根离子浓度为5mol/L）。 ④TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCL（pH8.0）、1 mmol/L EDTA（pH8.0）。 ⑤氯仿： 异戊醇（24:1） 将量取加入24ml 氯仿和1ml异戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4℃保存。 ⑥LB培养基（1000ml）：每升含胰化蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 15g，琼脂粉（固体培养基时用） 15g，用10M NaOH调pH为7.0，高压灭菌20min后，4℃保存。 ⑦70%乙醇 ⑧琼脂糖 ⑨1L 5×TBE备用溶液：54g Tris，27.5g 硼酸，20ml 0.5mol/L EDTA ，调pH 8.0。 ⑩6×加样缓冲液：0.25% 溴酚蓝、40%蔗糖。 其它试剂有：胰RNA酶、DNA Marker、硼酸、Goldview 试剂。 1.4实验方法 1.4.1质粒DNA的提取 ①取1.4 ml 含pUC19的大肠杆菌培养物于1.5ml 微量离心管中，6000r/min 离心2min，吸取上清液，并使细胞沉淀尽可能干燥； ②加100 ul 溶液Ⅰ悬浮细菌沉淀，强烈振动以充分混和均匀，冰浴室温放置5min； ③加200 ul 溶液Ⅱ，盖紧管口，轻缓上下4-6次颠倒离心管以混合内容物，冰浴室温放置5min； ④加150 ml 溶液Ⅲ，盖紧离心管口后上下轻缓颠倒4-6次，置冰上10 min； ⑤12000 rpm离心10 min，转移上清液至另一离心管； ⑥向上清液中加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），反复混匀，12000 rpm 离心10 min，取上清液移至另一离心管中； ⑦加2倍体积无水乙醇，震荡混匀，‐20