连接介导PCR及其在体内足迹研究中的应用.docVIP

连接介导 PCR 及其在体内足迹研究中的应用 3 纪新军 　刘德培 　梁植权 中国医学科学院基础医学研究所 中国协和医科大学基础医学院 医学分子生物学国家重点实验室 , 北京 100005) 摘要 　连接介导聚合酶链反应是以连接反应为基础的单侧 PCR 技术 , 首先在 DNA 片段的一端连接上 一个公共连接子 , 而后在这个连接子与另一个 DNA 序列特异的引物间扩增. Vent 聚合酶的使用 , 延 伸产物捕获及连接子标记选择策略的采用 , 大大提高了连接介导聚合酶链反应的敏感性. 这一技术的 发明大大促进了体内足迹等研究的进行. 关键词 　连接介导 PCR , 连接子 , 体内足迹法 　　常规的用来研究蛋白质2核酸相互作用的 方法 , 如 DNase Ⅰ足迹法 , 凝胶电泳阻抑法 , 甲基化干涉实验等 , 是体外方法 , 对于研究蛋 白质2DNA 间相互作用具有很大的作用 , 然而 体内结果常同体外情况不同 , 有时体外蛋白 质2DNA 相互作用实验检测到有蛋白质2DNA 间相互作用 , 但体内无蛋白因子结合 , 反之亦 然. 所以体外研究方法研究基因表达调控并不 总能真实反映体内的情况[ 1 ,2 ] . 体内足迹法 ( i n v i v o footp rinting) 是一 种研究体内蛋白质2DNA 相互作用的方法 , 它 能真实反映体内蛋白质2DNA 相互作用的情 况 , 而且可以检测体内的 DNA 构象的变化 , 是研究基因表达调控的有力手段. 但这种实验 要求有大量的细胞 , 而且特异性也不很好 , 限 制了它的使用[ 3 ] . 连接介导的聚合酶链反应 (ligatio n2medi2 ated polymerase chain reactio n , L M2PCR ) 的 发明 , 有力地促进了体内足迹技术在真核基因 表达调控研究方面的应用[ 4 ] . 现就 L M2PCR 的两个引物间得到指数性扩增 , 每个循环模板 增加 2 倍 , 经过 25～30 个循环后 , 单拷贝基 因可扩增到 106 倍 , 经典 PCR 不适用于立即 进行体内足迹研究 , 因为它要求有两个限定 端 , DNA 序列或足迹包括一组相关的核苷酸 片段 , 这些片段的一端被一个引物或酶切位点 固定. 所以对所有片段都是相同的. 另一端则 由于不同的化学裂解或链终止而对所有片段都 不相同 , 为了能够运用 PCR 进行体内足迹研 究 , 就要首先通过连接上一个连接子使所有片 段的另一端也相同. 然后在两个限定端间进行 PCR 扩增 , 即是所谓的连接介导的聚合酶链 反应 (L M2PCR) [ 4 ] . 　　L M2PCR 是一种以连接反应为基础的单侧 PCR 策略 , 它的敏感性较高 , 从 1 μg 的细胞 基因组 DNA , 哺乳类基因组的单拷贝基因经 过一夜就可获得实验结果. 这使得用少量细胞 或特定的切割组织进行体内足迹研究成为可 能[ 4 ] . L M2PCR 的原理见图 1 [ 4～6 ] . 　　 1 起始原料是化学法裂解的基因组 的原理及其在体内足迹方面的应用综述如下 : a 裂解后产生 3′和 5′磷酸基团. DNA , 1 　L M2PCR 原理 111 　基本原理 b1 用基因特异的引物 P1 与变性的基因组 DNA 退火 , 延伸 , 产生平末端 DNA , 同时也 限定了模板的一个末端. 聚合酶链反应 (polymerase chain reactio n , PCR) 由重复的模板变性 , 引物退火 , DNA 聚合酶延伸等过程组成 , 使 DNA 模板在限定 　3 国家自然科学基金资助项目 ( . 　收稿日期 : 1996206204 , 修回日期 : 1996209209 　　c1 上述的一端固定的一组 DNA 双链片段 成为 T4 连接酶的底物 , 用于与连接子连接起 来 , 基因组 DNA 提供 T4 连接酶连接时的 5′ 磷酸端 , 这时模板 DNA 的另一末端也被固 定. d1 经过连接的 DNA 变性后与基因特异的 第二引物 ( P2 ) 退火 , 延伸 , 这时的模板具 备了两个限定端. e1 两端被固定的模板用 P2 和长接头寡核 苷酸引物指导进行 PCR 扩增 , 经过 15～18 个 循环后 , 可扩增为原来的 104 倍. f 1 L M2PCR 的结果显示有以下两种方法 : 第一 , 运用一个末端标记的第三引物 ( P3 ) 延伸模板片段 , 然后进行测序分析 ; 第二 , L