SOD活性测定.docVIP

超氧化物歧化酶（SOD）活力测定 过氧化物酶（英文：Peroxidase）广泛存在于植物体中,是活性较高的一种酶.它与呼吸作用,光合作用及生长素的氧化等都有关系.在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化.一般老化组织中活性较高,幼嫩组织中活性较弱.这是因为过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素,增加木质化程度,而且发现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增加,所以过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标.此外,过氧化物同工酶在遗传育种中的重要作用也正在受到重视.过氧化物酶能催化过氧化氢氧化酚类,产物为醌类化合物,此化合物进一步缩合或与其他分子缩合,产生颜色较深的化合物. 学习和掌握氯化硝基四氮唑蓝（NBT）光化还原法测定SOD活力的方法和原理，并了解SOD的作用特性。 二、原理 SOD是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的SOD：Mn－SOD和Cu.Zn－SOD，它们都催化下列反应： 由于超氧自由基（O2.－）为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD活性一般为间接方法。并利用各种呈色反应来测定SOD的活力。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O2.－，当加入NBT后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲月替 （ 黄 色 ） ，继而还原生成二甲月替 ，它是一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。当加入SOD时，可以使超氧自由基与H+结合生成H2O2和O2，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲月替 生成速度减慢。通过在反应液中加入不同量的SOD酶液，光照一定时间后测定560nm波长下各液光密度值，抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比，以酶液加入量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，在坐标纸上绘制出二者相关曲线，根据SOD抑制NBT光还原相对百分率计算酶活性。找出SOD抑制NBT光还原相对百分率为50％时的酶量作为一个酶活力单位（U）。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1．实验材料 小麦、玉米、水稻、棉花等新鲜叶片 2．主要仪器 （1）722型或其他型号的可见分光光度计（2）万分之一分析天平 （3）高速冷冻离心机（4）冰箱（5）光照箱：4 500Lux（6）带盖瓷盘 1个/处理（7）移液管架（8）研钵（9）离心管 5mL数个（10）微烧杯 10～15mL 8个/处理（11）移液管或加样器 0.5mL×4；1mL×2；2mL×2；5mL×1（12）微量进样器 50μL×2；100μL×2（13）烧杯 50mL×3；100mL×5；500mL×1；1 000mL×2（14）量筒 50mL×1；100mL×2（15）容量瓶 50mL×1；100mL×5；250mL×1；1 000mL×2（16）细口瓶 125mL×5 3．试剂 （1）0.1 mol/L pH7.8磷酸钠（Na2HPO4-NaH2PO4）缓冲液 A液（0.1 mol/L Na2HPO4溶液）：准确称取Na2HPO4· 12H2O（MW=358.14）3.5814g于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。 B液（0.1 mol/L NaH2PO4溶液）：准确称取NaH2PO4· 2H2O （MW=156.01）0.780g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入50mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。 取上述A液183mL与B液17mL充分混匀后即为0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液。4℃冰箱中保存备用。 （2）0.026 mol/L 蛋氨酸（Met）磷酸钠缓冲液 准确称取L-蛋氨酸（C5H11NO2S，MW=149.21）0.3879g于100mL小烧杯中，用少量0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液溶解后，移入100mL容量瓶中并用0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液定容至刻度，充分混匀（现用现配）。4℃冰箱中保存可用1～2d。 （3）7.5 × 10－4 mol/L NBT溶液 准确称取NBT（C4OH3OCl2N10O6，MW=817.7）0.1533g于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入250mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀（现配现用）。4℃冰箱中保存可用2～3d。 （4）含1.0μmol/L EDTA的2 × 10－5 mol/L核黄素溶液 A液：准确称取EDTA（MW=292）0.00292g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。 B液：准确称取核黄素（MW=376.36）0.0753g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。 C液：合并A液和B液，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，此溶液为含0.1mmol/L