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木寡糖的研究 摘要：研究从啤酒酵母中提取和提纯蔗糖酶的方法技术。采用菌体的自溶的方法来破碎后菌体分离提取蔗糖酶液，再经过热提取、乙醇沉淀和柱层析法纯化蔗糖酶。通过蔗糖酶水解蔗糖测定各种提纯液的酶活；用Folin-酚试剂法和微量凯氏定氮法测蛋白含量并比较两种方法优缺点；再用SDS测定的相。通过对实验数据的分析得出用乙醇提纯液总活力最高，所含蔗糖酶比例最大 (Sucrase，EC 3．2．1．26)又称转化酶(Invertase)。可作用于B一1，2糖苷键，将蔗糖水解为葡萄糖和果糖。由于果糖甜度高，约为蔗糖的1．36～1．60倍在工业上具有较高的经济价值。以转化蔗糖，增加甜味，制造人造蜂蜜，防止高浓度糖浆中的蔗糖析出，制造含果糖和巧克力的软心糖，还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。目前关于酵母中蔗糖酶提取纯化方面的研究较多从中可以看到，每摩尔蔗糖水解产生两摩尔还原糖，蔗糖的裂解速率可以通过Nelson 法测定还原糖的产生数量来测定。一个酶活力单位规定为为在标准分析条件下每分钟催化底物转化的数量。比活力单位为每毫克蛋白含有的酶活力单位。啤酒醉母中含有丰富的蔗糖酶，本实验以它为原料，通过破碎细胞、热处理、乙醇沉淀柱层析等步骤提取蔗糖酶．并对其性质进行测定。除非特别说明，所有的纯化步骤均在0－4之间进行。external yeast invertase）, 其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶（internal yeast invertase），含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取。酶促动力学研究酶促反应的速度及影响速度的各种因素，而米氏常数K m 值等于酶促反应速度为最大速度的一半时所对应的底物浓度，其数值大小与酶的浓度无关，是酶促反应的特征常数。不同酶的Km 值不同，同一种酶在与不同的底物反应时，其Km 值也不同。K m 值反映了酶和底物亲和能力的强弱程度，K m 越大表明酶与底物的亲和力越弱；K m 值越小，表明酶与底物的亲和力越强。 酶的活力就是酶所催化的反应的能力，通常用单位时间内底物的减少或产物的增加来表示。酶反应过程中产物的生成和时间关系可以用进程曲线来说明，曲线的斜率就是酶反应过程中的反应速度。从进程曲线来看，在一定时间内反应速度维持恒定．但随着时间的延长，反应速度逐渐降低，这是由多种因素造成的。为了准确表示酶的反应速度通常采用初速度表示。酶活力可以被某些物质改变(激活或抑制)。凡能降低酶的活性甚至能使酶失活的物质，均称为抑制剂，其中又有可逆抑制和不可逆抑制类型。而可逆的抑制又包括有竞争性抑制、非竞争性抑制等类型。在有抑制剂存在的条件下，酶的一些动力学性质会发生改变，如K m，Vmax 等。而酶的K m、Vmax 可通过作图法求得，其方法很多，最常用的就是双倒数作图法)。前言生物体内所发生的一切化学反应，几乎都是在专一性酶的催化下进行的，因此酶的研究对了解生命活动的规律以及生命本质的阐述具有十分重要的意义。随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究以及其他研究，越来越需要纯度高的酶制剂。由于酶本身也是蛋白质，因此酶分离提存的方法大体上与蛋白质纯化方法相同，一般来说，没有一种固定的方法，而往往根据你所要分离提纯酶的取材以及酶本身的物理﹑化学及生物学性质来确定分离提纯方法。各种酶的纯化通常有五个阶段：①材料的选择与预处理；②细胞破碎；③抽提；④纯化；⑤浓缩﹑干燥及保存。酶分离纯化成功与否的重要标志，一是要有较高的收率，二是达到所要求的纯度，这两个指标通常是矛盾的，可根据需要来有所侧重，一般来说，好的方法与步骤应该是简单易行，最终的酶制剂有较高的收率和纯度。在分离提纯过程中，应该尽量避免引起蛋白质变性的各种因素，此外，在分离提纯前，必须建立对酶的分析鉴定方法，以正确指导分离提纯地进行。 本实验用细胞自溶法提取酵母中的蔗糖酶，并用热提取、乙醇沉淀和QSepharose柱层析法纯化，比较其酶活力。用蔗糖酶水解蔗糖通过绘制葡萄糖标准曲线计算后测出酶活力。用 Folin-酚试剂法和微量凯氏定氮法测蛋白含量，再用SDS测定的相。 从而得到啤酒酵母蔗糖酶的一系列数据。材料与方法.2? 材料 方法选择小鼠.3.2?含选择提纯的一般原理和步骤 机溶剂分级和透析技术 （3）掌握柱层析的原理和方法 （4）学会3，5—二硝基水杨酸比色定