基本蛋白质实验.pptVIP

* * * * * * * * * * Immunochemistry 基本原理： 应用抗原与抗体结合的免疫学原理，检测细胞或组织中多肽、蛋白质及膜表面抗原和受体等大分子物质的存在与分布。 组织固定、石蜡包埋、切片、脱蜡 过氧化氢灭活内源性过氧化物酶 微波修复抗原 封闭 一抗、二抗孵育孵育 DAB显色 苏木素—伊红（HE）复染 免疫组化法一般实验过程 Key points 蛋白质组及蛋白质组学概念 双向电泳的原理 比较蛋白质组学实验流程 几种功能蛋白质组学研究方法的基本原理 Western blotting的基本原理及操作中的注意事项 E-mail : yangjiyao123@163.com * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 几种基本蛋白质实验技术 SDSWestern blotting Southwestern blotting Immunochemistry SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 基本原理：根据蛋白质分子量不同分离复杂蛋白质成分。 1.制备凝胶试剂： 丙烯酰胺（单体） 亚甲双丙烯酰胺（胶联剂） 二者比例29 ：1 母液浓度30% 过硫酸铵（引发剂） N,N,N,’N’-四甲基乙二胺（ TEMED） (加速剂) 十二烷基磺酸钠（SDS）（阴离子变性剂） SDS试剂 2.蛋白上样缓冲液 3.电泳缓冲液? 4.考马斯亮蓝R250染色液 5.脱色液 SDS实验过程流程如下： 凝胶制备 蛋白样品制备及上样 电泳 卸胶 染色 脱色 凝胶制备 梳子孔 分离胶 浓缩胶 分子量范围与凝胶浓度 分子量范围(KDa) 凝胶浓度范围 100 4%-7% 10-100K 8%-15% 10 20%-30% 12% SDS凝胶成分（15ml） 试剂及浓度 12%分离胶 纯水 4.9ml 30%丙烯酰胺 6.0ml 1.5M Tris-Cl（pH8.8） 3.8ml 10%SDS 150ul 10%过硫酸胺 150ul TEMED 4ul 5% SDS凝胶成分（6ml） 试剂及浓度 5%浓缩胶 纯水 4.2ml 30%丙烯酰胺 0.99ml 1.0M Tris-Cl（pH6.8） 0.75ml 10%SDS 60ul 10%过硫酸胺 30ul TEMED 3ul 蛋白样品制备及上样 每个加样孔所上样蛋白总量要适中 过高:蛋白条带扭曲 过低:蛋白条带染色浅 蛋白样品需与上样缓冲液混合(1:1) 2×SDS凝胶上样缓冲液(100mM/L Tris-Cl(pH6.8)， 200mM/L DTT，4%SDS，0.2%溴