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外源DNA与λ噬菌体载体重组 野生型λ噬菌体体基因组是双链线性DNA分子，全长为48，502bp，其中约40%的核苷酸序列是噬菌体生存非必需的，可被外源DNA片段取代，利用这一性质，从1974年以来，已成功构建了适用于不同目的的许多λ载体。一般来说，λ噬菌体作为载体分为两类，即插入型载体和取代型载体。插入型载体在λ噬菌体的非必需基因内，有一种或多种限制性内切酶的单一位点供外源基因片段插入，产生的重组子并不丢失载体上的任何一段基因，所以它比原载体要长。由于超过野生型λDNA分子长度5%的重组噬菌体的包装效率要比正常长度的噬菌体DNA低得多，因而插入型载体的容量较小，最多为9kb左右。取代型载体在λ噬菌体DNA的中央非必需区，具有同种限制性内切酶的两个酶切位点，所以用同一种限制性处理载体，可以将载体切割成三段，左、右两臂和中央片段，用适当方法分离得到左、右两臂去除中央片段，然后与外源DNA片段连接，产生中央区被个源基因取代的λDNA，由于少于λDNA长度78%或多于其长度105%的重组子，不能被有效地包装成噬菌体颗粒，所以重组λDNA的包装范围是38～51kb，两臂长度之和约为29kb，因此插入片段的长度范围为9～22kb。当重组分子的大小接近野生型48.5kb的长度时，重组DNA的包装效率较高，当重组DNA的大小接近极限时，包装效率较低，因此插入片段的最适值为19～20kb。 一、载体DNA的制备 λ噬菌体载体DNA的制备可参照上节λDNA制备方法。首要的是选取适合于该载体DNA的宿主菌。在感染宿主菌进行λ噬菌体裂解性繁殖时，选择合适的宿主菌和噬菌体的比例，将会获得较满意的噬菌体产量。 在一些情况下，只要用限制酶消化的方法，就可将制备的λ噬菌体直接进行克隆。例如，如果应用一个可以对携带外源DNA序列的重组噬菌体进行遗传学筛选的载体(如EMBL系列、λ2001、λDASH或λgt10)无须采取步骤来降低非重组噬菌体的形成。此外，在某些情况下(如克隆一个纯化的DNA片段时)，非重组噬菌体无碍大局，因为用噬斑杂交法很容易筛选出所需要的重组噬菌体。但是，许多克隆过程需要在外源基因片段与载体进行重组之前，用酶切割载体DNA，并去除载体的中央片段，以利于载体两臂与供体DNA片段的重组连接。 (一)载体DNA的酶解 1.单酶切反应：反应缓冲液为150mmol/LNaCl、6mmol/LTris-HCl(pH7.9)、6mmol/LMgCl2、100μg/ml的牛血清清蛋白(若没有无DNase级别的BSA，可以不加，切不可用一般BSA替代)。DNA浓度为100～150μg/ml，反应总体积最好不超过0.5ml通常以0.2～0.5ml为宜。酶量为2～3U/μgDNA，37℃水浴保温1～2小时，不宜采用过长的酶解时间。反应管置0℃冰浴终止反应的含EDTA和甘油的溴酚蓝染液，于65～68℃水浴加热10分钟，使粘合的cos位点解开，再在0.5%琼脂糖凝胶上电泳，检查酶解反应是否完全，电泳时用不经酶切的DNA作对照。 2.双酶切反应：EMBL系列载体、λ2001、λDASH、Charon34、35和40等λ噬菌体载体在中央片段，两端的多克隆位点区内都含有方向相反的一系列限制酶切位点。例如，在EMBL3A载体左侧多克隆位点的限制酶切位点的顺序为SalⅠ-BamHⅠ-EcoRⅠ，而右侧多克隆位点的限制酶切位点的顺序为EcoRⅠ-BamHⅠ-SalⅠ。用BamHⅠ和EcoRⅠ对该载体进行双酶切，就可产生带有BamHⅠ末端的左右臂、带用EcoRⅠ末端的中央片段和带有BamHⅠ末端和EcoRⅠ末端的多克隆位点小片段。该小片段用异丙醇沉淀或用SepharoseCL-4B离心柱层析法很容易除去，由于BamHⅠ末端与EcoRⅠ末端不互补，噬菌体左右臂不能与中央片段连接。这样，就可使非重组噬菌体的数目降低2个数量级。如果这种方法与遗传学筛选方法(例如Spi)并用，非重组噬菌体的数目还可再降低2～3数量级。这样的筛选法可用于噬菌体载体EMBL、λ2001和λDASH。 按照上述单酶切反应的条件，用两种适当限制酶中之一消化载体DNA。通过凝胶电泳检查酶切是否完全。用酚∶氯仿抽提1遍，用氯仿抽提1遍，纯化DNA。用乙醇沉淀水相，回收DNA。用TE(pH7.6)溶解DNA至浓度为100～150μg/ml。取出一小份样品(0.5μg)贮存于-20℃。用第二种限制酶消化DNA，加入4倍过量的限制酶，温育4小时。于68℃加热10分钟后，用0.5%琼脂糖凝胶电泳检查两次酶解反应是否完全。 3.酶解产物的处理：电泳鉴定证实酶反应完全后，产物需用等体积的酚或者酚氯仿-异戊醇的混合液抽提两次，使酶彻底灭活，抽提后的水相(