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第三节 细菌形态与结构检查法 【教学内容】细菌的显微镜放大法和染色检查法法。 【教学要求】 掌握： 细菌的染色检查法。 　了解： 细菌的显微镜放大法。 【教学重难点】  重点：细菌的染色检查法。  　难点：细菌的染色检查法。 【教学时数】：2学时 【教学方法】：讲授法为主，演示法为辅。 显微镜放大法——细菌形体微小，肉眼不能直接看到，必须借助显微镜（普通光学显微镜、电子显微镜）放大后才能观察。 染色检查法——细菌体小,半透明，经染色后才能观察较清楚。 普通光学显微镜的分辨率为0.25um。一般细菌都大于0.25um，故可用普通光学显微镜观察。 电子显微镜的分辨率为1nm。不仅能看清细菌的外形，内部超微结构可一览无余。 （一）单染色法 1、原理 　　细菌的体积小，五色半透明，在普通光学显微镜下不易观察清楚，通常需染色来增加菌体与背景之间的色差，这比不染色标本清楚易辨。 由于细菌的等电点为pH2～5，在接近中性的环境中通常带负电荷，易与带正电荷的碱性染料相结合而染上颜色，故常用亚甲蓝、碱性复红、草酸铵结晶紫等染料染色。单染法只使用一种染料，所染的细菌均被染成一种颜色，一般能够显示细菌的形态、排列和大小，但不能显示细菌的内部构造。 ２、常用染料和器具 　　 　　大肠杆菌和金黄色葡萄球菌18～24h培养物，生理盐水，亚甲蓝染色液，碱性复红染液，香柏油，二甲苯，显微镜，接种环，吸水纸，载玻片，酒精灯，擦镜纸。 ３、方法 （1）涂片 　　取洁净的载玻片一块，滴一小滴生理盐水于载玻片中央(如被检材料是液体，可不加生理盐水)。将接种环在酒精灯火焰上灭菌，冷却后，伸人被检菌试管取菌少许(切不可多，更不可将培养基刮下)，混入载玻片上的生理盐水中，磨匀并涂抹成直径1．5cm左右的均匀薄层菌膜。将接种环灭菌后放回原处。 （2）干燥 涂片最好在室温中让其自然干燥。有时为了干燥得快些也可在酒精灯火焰上方烘干，但勿紧靠火焰；也可以用吹风机吹干。 ３、方法 （3）固定 让菌膜面朝上，将载玻片在酒精灯火焰外层来回通过3次，此为“固定”。目的是使细胞质凝固，以固定细菌的形态，并使细菌粘附于玻片上，染色和水冲时不会脱落。 （ 4）染色 将细菌涂片平置，滴加1滴亚甲蓝(或复红染液)于菌膜上，染液以覆盖涂抹的标本为度，染色1—2min。 （ 5）水洗 斜置载玻片，用细水流从上端流下洗去多余的染液。 （ 6）干燥 自然干燥或用吹风机吹干水分。 （7）镜检 先用低倍镜找到物像，并将物像调到视野中央，再于标本上滴上一滴香柏油，置于油镜下进行观察。 ４、注意事项 （1）固定时温度不可过高，以载玻片反面触及皮肤时热而不烫为宜。 （2）水洗时，不要对着标本直接冲洗，以免冲去被检标本，一般以冲洗下来的水基本无色为度。 （3）染色完毕，倾去水分，于室温中自然干燥，不可在标本上擦试，以免擦损标本。 （二）革兰染色法： C.Gram（革兰）于1884 年发明的一种鉴别不同类 型细菌的染色方法。 ２、染色原理 第一步：结晶紫使菌体着上紫色 第二步：碘和结晶紫形成大分子复合物，分子大，能被细胞壁阻留在细胞内。 第三步：酒精脱色，细胞壁成分和构造不同，出现不同的反应。 G+ 菌：细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联度大，当乙醇脱色时，肽聚糖因脱水而孔径缩小，故结晶紫-碘复合物被阻留在细胞内，细胞不能被酒精脱色，仍呈紫色。 Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，因其含脂量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，酒精将细胞脱色，细胞无色，沙黄复染后呈红色。 ３、结果判断 菌体呈紫色的为革兰氏阳性菌（G+） 菌体呈红色的为革兰氏阴性菌（G-） ４、注意事项 （1）载玻片要洁净无油。 （2）涂片以匀薄为佳，切不可浓厚。过于密集的菌体，因洗脱不匀常呈假阳性。 （3）要严格控制各试剂的作用时间，尤其是酒精脱色，时间过短，革兰阴性菌可染成紫色造成假阳性；反之，脱色时间过长，革兰阳性菌也可被染成红色造成假阴性。 （4）碘液配制后，应装在密闭的暗色瓶内储存。如因储存不当，试液由原来的红棕色 变成淡黄色，则不宜再用。 本次课作业 １．细菌染色前，为什么必须固定? ２．为什么滴加香柏油镜检前要干燥? ３．哪些条件影响革兰染色效果?其关键步骤是什么? ４．革兰染色法有何实际意义? ５．比较单染法与复染法的优、缺点。 ６．在细菌的结构中与革兰氏染色有关的结构是： A、中介体；B、核质；C、细胞膜；D、细胞壁 * １、普通光学显微镜(light microscope) 一