微生物实验讲稿.docVIP

实验一 油镜的使用和细菌的简单染色法 ??一、目的要求 ????1. 学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色方法。 ????2. 初步认识细菌的形态特征。 ????3.掌握无菌操作技术。 ??二、基本原理 ????虽然可以用相差显微镜等直接观察微生物的形态特征，但其应用有局限性?；用电子显微镜可以观察到微生物的各种形态结构，但因其价格昂贵、设备条件要求高、操作也较复杂，应用上也受一定限制。所以，一般实验室仍常用普通光学显微镜来进行微生物形态学特征的观察。然而，微生物（尤其是细菌）细胞小而透明，当把菌悬液浮于水滴内，用光学显微镜观察时，由于菌体和背景没有显著的明暗差，因而难以看清它们的形态，更不易识别其结构，所以，用不同光学显微镜观察细菌时，往往要先将细菌进行染色，借助于颜色的反衬作用，可以更清楚地观察到细菌的形状及某些细胞结构。因此，为了研究微生物的形态特征和鉴别不同类群的微生物，微生物的染色及形态结构的观察是微生物实验中十分重要的基本技术。 用于微生物染色的染料，是一类苯环上带有发色基团和助色基团的有机化合物。发色基团赋予化合物的颜色特征，助色基团则给予化合物能够成盐的性质，仅含发色基团的苯化合物（称色原）即使带有颜色也不能作为染料，因为它不能电离，不能与酸或碱形成盐，对微生物（或其他材料）没有结合力，很容易被洗脱或机械方法除去。染料通常都是盐，分酸性染料和碱性染料两大类。在微生物染色中，碱性染料较常用，如常用的美蓝（即亚甲蓝）、结晶紫、碱性复红、番红（即沙黄）、孔雀绿等都属于碱性染料。 简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。 常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电，荷酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。 当细菌分解糖类产酸使培养基 pH 下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。 ??三、器材 ????1. 菌种 枯草芽孢杆菌 12-18h 营养琼脂斜面培养基，金黄色葡萄球菌约 24h 营养琼脂斜面培养物。 ????2. 染色剂 吕氏碱性美蓝染液（或草酸铵结晶紫染液），齐氏石炭酸复红染液。 ????3. 仪器或其他用具 显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，生理盐水等。 ??四、操作步骤 ????1. 涂片 取两块载玻片，各滴一小滴-生理盐水（或蒸馏水）于玻片中央、用接种环以无菌操作分别从枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。若用菌悬液（或液体培养物）涂片，可用接种环挑取 2-3 环直接涂于载玻片上。 载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌不宜过多；涂片要涂均匀，不宜过厚。 ????2. 干燥 ???????室温自然干燥或酒精灯干燥。 ????3. 固定 涂面朝上，通过火焰 2-3 次。 此操作过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。 热固定温度不宜过高（以玻片背面不烫手为宜），否则会改变甚至破坏细胞形态。 ????4. 染色 将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。 吕氏碱性美蓝染色 1~2min ；石炭酸复红 ( 或草酸铵结晶紫 ) 染色约1min 。 ????5. 水洗 倒去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。 水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下。水流不宜过急，以免涂片薄膜脱落。 ????6. 干燥 自然干燥，或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。 ????7. 镜检 ?涂片干后镜检。 涂片必须完全干燥后才能用油镜观察。最后清理显微镜。 ??五、实验报告 ????1 .结果 ???????根据观察结果，绘出两种细菌的形态图。 ????2 .思考题 ??????(1) 你认为制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环节？ ??????(2) 为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察 ? ??????(3) 如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题 ? 如果加热温度过高、时间太长，又会怎么样呢？ 实验二 革兰氏染色法、细菌的芽孢染色 ??一、目的要求 ????1. 学习并初步掌握革兰氏染色法。 ????2. 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 ??二、基本原理 革兰氏染色法是 1884 年由丹麦病理学