体验制备细胞膜的方法.docVIP

【实验4】体验制备细胞膜的方法 北京市第十五中学　王　莉 ? 1．体验用哺乳动物红细胞制备细胞膜的基本方法。 ? 2．使用高倍显微镜观察制备细胞膜过程中细胞的变化。 ? 背景资料? ? 生物膜的研究发展迅速。要研究生物膜的组成、结构及功能，首先必须分离出纯净的细胞膜。分离得到的哺乳动物的红细胞膜，一般称为“血影”。哺乳动物成熟的红细胞中没有一般真核细胞所具有的细胞核和细胞器，容易用它制备纯净的细胞膜。此外，哺乳动物的血液也比较容易获得，因而是研究细胞膜的理想材料。 ? 从哺乳动物的红细胞中分离细胞膜，第一步是将血液收集在加有抗凝剂的容器内，用低速离心的方法从血液中分离出红细胞，然后用等渗缓冲液反复洗涤，经多次离心，去除血浆。第二步是在红细胞中加入低渗缓冲液，由于低渗溶液的作用，大量水分进入细胞，使红细胞胀破而溶血。第三步是将溶血的红细胞反复而充分地高速离心、洗涤，去除血红蛋白和其他的细胞内含物，最终获得比较纯净的红细胞膜。 ? 操作指南 ? 1．材料? 新鲜的哺乳动物血液 ? 2．用具? 离心机，离心管，滴管，显微镜，载玻片，盖玻片，吸水纸，小烧杯。 ? 3．试剂? 柠檬酸钠或肝素（抗凝剂），生理盐水（质量分数为0．9%的NaCl溶液），蒸馏水或清水。 ? 4．操作要点 ? 教师在实验前做以下准备工作。 ? 准备一定量的新鲜的哺乳动物血液，如羊血或猪血，在冰箱中静置一昼夜。用滴管将上清液吸去。再吸取1 mL的沉淀物，放入离心管中，加入生理盐水2 mL，在2 000 r/min条件下离心5 min。去除上清液，在沉淀中再加入生理盐水2 mL，再离心一次，去除上清液，留沉淀备用。以上操作的目的是洗去血浆成分，避免血浆对血细胞的缓冲作用，从而使红细胞的溶血现象更加明显。 ? 学生的实验操作如下。 ? （1）取一个5 mL的小烧杯，加入生理盐水2～3 mL。 ? （2）用滴管在沉淀的下层吸取一小滴血细胞，滴入小烧杯的生理盐水中，以达到稀释红细胞的目的，以免观察时，由于细胞密度太大，影响观察效果。 ? （3）取另一个滴管，在小烧杯中轻轻搅拌，然后吸取少量的血细胞稀释液，在载玻片的中央滴很小的一滴，加盖玻片。 ? （4）先在低倍镜下观察红细胞的正常形态，可见其边缘完整发亮。 ? （5）在盖玻片的一侧加一滴蒸馏水或清水，在另一侧非常小心地用吸水纸慢慢地吸引，防止把红细胞全部吸入吸水纸中而影响观察。边加水边观察，注意红细胞的形态变化。红细胞会随着水流向一侧漂移，观察时注意移动玻片。红细胞体积逐渐变大，变得非常鼓胀，在视野中可以找到少数胀破的红细胞，它们已失去完整发亮的边缘，变成弥散状。 ? 5．需要注意的几个问题 ? （1）制作临时装片时，红细胞必须稀释，而且取红细胞的量要少。 ? （2）在高倍镜下观察，待观察清晰时，在盖玻片的一侧滴加蒸馏水，同时在另一侧用吸水纸吸引。上述操作均在载物台上进行，并随时调整镜筒高度，持续观察细胞的变化。在盖玻片一侧滴加蒸馏水的量要少，不能让盖玻片处于漂浮状态；同时在另一侧用吸水纸吸引时要小心，不要将血细胞吸走。 ? （3）要想取得好的观察效果，所用显微镜的放大倍数应在400倍以上。 ? （4）操作中要认真观察才能看到连续的变化过程。 ? 教学设计? ? 1．分析实验原理 ? [提问引入] ? 科学家要研究细胞膜，首先要解决的问题，是获得相应的实验材料，即细胞膜。用哪种细胞来制备细胞膜比较合适呢？为什么？ ? 请学生讨论。 ? 根据学生回答的情况，加以归纳总结。科学家发现，哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核，而且细胞质的结构也比其他真核细胞简单得多，是制备细胞膜的理想材料。 ? [进一步提问] ? 怎样才能获得纯净的细胞膜呢？直接剥离可以吗？有没有间接的方法？ ? 根据学生的回答，肯定溶血的方法。再进一步提问，如何将细胞膜与细胞其他成分分离开？引导学生了解离心技术的应用。由于细胞膜非常薄，通常要在5 000 r/min及9 000 r/min条件下反复离心多次，才能得到纯净的细胞膜。由于时间和条件的限制，我们在课上只用显微镜来观察红细胞溶血前后细胞边界的变化，以此来体验细胞膜的存在，并对细胞膜的制备方法有一个初步的体验。 ? 2．明晰实验步骤 ? 让学生讨论，设计具体的实施步骤。 ? 教师对学生设计的步骤进行补充完善。具体实施步骤参见“操作指南”。 ? 关于操作要点和难点，可以提出以下问题引发学生思考。例如，在载玻片上滴加的血细胞多些好还是少些好？在盖玻片另一侧用吸水纸吸引时，要注意什么？如何把握观察溶血后的红细胞的最好时机？教师针对问题，指出操作要点并讲明原因。 ? 3．分组实验 ? 学生进行分组实验，教师给予具体的指导和评价。 ? 4．展示和讨论实验结果 ? 可以把教材中红细胞溶血前后的照片在投影上展示。 ?