第二章沉淀法.ppt

第二编 纯化方法第二章 沉淀法 基本原理与沉淀类型 一、基本原理 二、制备蛋白质 三、制备核酸 几种主要沉淀方法比较 (一). 盐 析 法 1 盐析原理 2 盐分级沉淀 3 盐析曲线制作 4 盐析的影响因子 5 脱盐 2 盐分级沉淀 ⑴ 盐的选择: 一般选择硫酸铵 调整硫酸铵溶液饱和度计算表(25度) 3 盐析曲线的制作 如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据可以借鉴，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。 4 盐析的影响因子 (1) 盐析常数 ks ks—表示有效成分溶解度降低的速率与盐浓度之关系，ks值大 ，说明溶解度降低的速度随盐浓度的增加而快速降低。对一种成分而言， ks值越大，其分级范围就窄，盐析效果就好。它与蛋白质本身的性质、溶液的pH、温度、盐的种类等有关。 (2)盐分级范围的差异性 当分离两种以上蛋白质时，每种ks值都很大，而且 盐析范围差异明显，则分离效果好； ks值大，盐析范围差异小，分离效果不好。 a.透析袋的处理（除去金属离子和水解酶） 在含1mmol/L EDTA的2%碳酸氢钠溶液中煮沸10分钟，用镊子取出，经蒸馏水煮沸，漂洗可用，老化后容易破裂。 b.透析液选择 低离子强度的中性缓冲液，适量酶的保护剂，防止微生物生长的0.02%叠氮钠(NaN3) c.掌握透析时间 体积比（１：２０），搅拌与否 检查：硫酸铵—氯化钡（10%） 氯化钠—硝酸银（10%） （二）有机溶剂沉淀法 　　 1、基本原理： 　　①　降低水溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。 　②　破坏大分子周围水膜，由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用。 2、常用试剂：甲醇、乙醇、丙酮 用量计算：与盐析饱和溶液法相同 应注意： A、核酸溶液中含高浓度盐类或多糖类物质时，水相和有机相位置会颠倒。 B、要通过适当的振荡或旋转来使有机溶剂起作用。核酸分子越大，应越温和。 C、苯酚应经过处理。（Tris-酚） D、苯酚/氯仿/异戊醇（24/24/1） E、最后用乙醚除去苯酚、氯仿。 核酸相 Protein变性相 有机相 (1) 有机溶剂 A、乙醇-盐溶液 通常：DNA--（浓度0.1μg/ml）+0.1mol/L NaCl(1/10体积加入)—用2倍体积冷乙醇 RNA-- （浓度0.1μg/ml）+0.1mol/L NaCl(1/10体积加入)—用2.5倍体积冷乙醇 （沉淀时间取决于核酸分子大小、浓度和温度） B、异丙醇 DNA（大分子rRNA）+0.3mol/L NaAc+0.54 ~1倍体积异丙醇 大分子DNA可用玻璃棒缠绕其上，小分子以凝胶形式沉淀，最后用70-75%乙醇洗涤除去盐及其他小分子物质。自然或真空干燥即可。 （4）聚乙二醇 PEG浓度取决于核酸片段大小，适宜不同大小片段的分离。 （5）十六烷基三甲基溴化铵（CTAB） 适宜多糖含量高的溶液，可选择性沉淀核酸，多糖滞留在溶液中。核酸-CTA共沉物需经后处理才能得到核酸(0.1M NaAc+70%乙醇)。 6 DNA与RNA 的分离 A、盐析法 DNA溶于1~2mol/L NaCl溶液 RNA溶于0.14mol/L NaCl溶液 B、酶水解法 可分别使用（DNA）RNase