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抗菌肽cecropin-Xm在大肠埃希菌中的串联表达与抑瘤作用_药学论文 抗菌肽cecropin-Xm在大肠埃希菌中的串联表达与抑瘤作用_药学论文 作者：沈益 劳学刚 耿伟 张洪祖 徐贤秀 【摘要】 在TNFα基因3′端连接抗菌肽cecropin-Xm基因多拷贝串联体，与温度诱导的表达载体pRCs组成表达载体pRCs-TNFα-(cecropin-Xm)n(n=1，2，3)，并在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达融合蛋白TNFα-(cecropin-Xm)n(n=1，2，3)。SDS结果显示，在同样表达条件下应用BL21(DE3)/pRCs-TNFα-(cecropin-Xm)2表达系统可获得比BL21(DE3)/pRCs-TNFα-cecropin-Xm系统多出一倍的目的物cecropin-Xm。融合蛋白经CNBr切割后用CM52纤维素柱分离纯化得到纯度大于95%的具有抑菌活性的抗菌肽cecropin-Xm，体外MTT抑瘤实验表明cecropin-Xm具有广谱杀灭肿瘤细胞的作用并且对正常细胞影响极小。 【关键词】 抗菌肽； Cecropin-Xm； 基因串联； 抑瘤作用 抗菌肽cecropins是瑞典科学家Boman于1980年首先从惜古比天蚕中发现的［1］，后来在其它蚕类、昆虫和哺乳动物［2，3］中发现了各种类型的抗菌肽，其中包括多种cecropin类的抗菌肽。抗菌肽cecropins一般由33～39个氨基酸组成，具有高度的同源性，对革兰阳性菌和阴性菌都有杀伤力，对正常真核细胞没有影响［4］。有实验表明，抗菌肽的作用对象和作用机制各异，其中某些抗菌肽可以通过引起肿瘤细胞凋亡［5］和激活经典的补体途径等来杀伤肿瘤细胞［6］。 为了更好的研究cecropin类的抗菌肽，本实验室参照抗菌肽CMIV［7］的氨基酸序列，用化学方法合成了编码抗菌肽CMIV突变体cecropin-X的cDNA［8］，并在大肠埃希菌中进行表达研究［9］。为了获得易于后期纯化且稳定的表达系统，在pRC系统［10］中完成了抗菌肽cecropin-X基因与TNFα(天然型肿瘤坏死因子)的融合表达［11］。为了从源头上提高抗菌肽的产量，首先利用PCR方法在cecropin-X基因末端加入了甲硫氨酸的密码子， 得到了cecropin-Xm基因； 再将cecropin-Xm基因串联在TNFα基因的3′-端。在此基础上，完成了TNFα-(cecropin-Xm)n(n=1，2，3)的串联表达，纯化得到了与cecropin-X具有同样抑菌活力的高纯度的cecropin-Xm。在体外实验中，cecropin-Xm对多种人源肿瘤细胞表现出明显的抑制作用。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 菌种和质粒 克隆宿主菌E.coli TOP10，表达宿主菌E.coli BL21(DE3)由本实验室保存；测活菌E.coli K12D31由斯德哥尔摩大学Boman教授馈赠；质粒pRC(含PR启动子的原核高效表达载体，温度诱导表达)由中国科学院上海生物工程研究中心陈常庆教授馈赠［10］。 1.1.2 酶、试剂和层析介质 各种限制性内切酶和T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、琼脂糖均购自TaKaRa公司；酵母抽提物和胰蛋白胨为英国Oxoid公司产品； CNBr为Sigma公司产品；氨苄西林购自上海新先锋制药厂； SE Perfect 100bp DNA ladder购自上海申能博彩公司；SDS分子量标准蛋白购自中科院生化所；低分子量标准蛋白质为Promega公司产品；其它化学试剂均为国产分析纯；CM-52纤维素购自Amershma Phamacia公司。PCR引物合成和基因测序由上海申能博彩公司完成。 1.1.3 细胞株 人肝癌细胞HepG2和QGY-7703、人胃癌细胞BGC-823、人大肠癌细胞LOVO、人宫颈癌细胞Hela、人白血病细胞U937和HL60由本实验室保存；人胚肝细胞HL-7702由东南大学遗传中心谢维教授馈赠。PRMI1640购自Gibco公司；小牛血清购自杭州四季青生物工程公司；MTT购自Sigma公司。 1.1.4 主要仪器和设备 SCS-24型摇床(上海市离心机械研究所)；5415R型台式离心机(Eppendorf公司)；PTC-100型PCR仪(Bio-RAD公司)；1100 System高效液相色谱仪(Agilent公司)；SAFIRE型多功能酶标仪(TECAN公司)。 1.2 方法 1.2.1 表达载体pRCs的获得 (1)取质粒pRC用EcoRI和PstI酶切后回收；(2)合成互补的寡核苷酸链 ①5′-AATTCGTCGACGGATCCCTGCA-3′和②5′-GGGATCCGTCGACG-3′，加入T4 DNA连接