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构建由缺氧反应元件修饰的hTERT核心启动子引导FCY1基因表达的复制缺陷型腺病毒_医学论文 构建由缺氧反应元件修饰的hTERT核心启动子引导FCY1基因表达的复制缺陷型腺病毒_医学论文 作者：李立文　王臻　苏明权　马越云　于文彬　李哲 【关键词】 腺病毒科 关键词: 低氧反应元件转录靶向端粒，末端转移酶腺病毒科遗传载体 摘 要:目的 构建由缺氧反应元件串联重复体修饰的人端粒酶逆转录酶（hTERT）核心启动子引导酵母胞嘧啶脱氨酶FCY1基因表达的复制缺陷型重组腺病毒. 方法 人工设计缺氧反应元件串联重复序列，克隆后插入hTERT启动子上游并经测序证实.将修饰后的hTERT启动子和酵母胞嘧啶脱氨酶基因FCY1插入穿梭质粒，与辅助质粒共转染HEK293细胞，重组产生复制缺陷型腺病毒. 结果 获得了由3倍和6倍缺氧反应元件修饰的hTERT核心启动子引导FCY1基因表达的复制缺陷型重组腺病毒. 结论 基于Cre重组酶/loxP的腺病毒载体构建系统操作简便、重组效率高. 　　Keywords:anoxiaresponse elementstranscriptional target-ingtelomeraseadenoviridaegenetic vectors Abstract:AIM To construct replication-defective recombi-nant adenovirus with FCY1driven by multimer of hypoxia re-sponsive elements-modified hTERT core promoter.METH┐ODS Multimer of hypoxia responsive elements were de-signed and cloned upstream to the hTERT core promoter，then confirmed by sequencing.The modified hTERT promot-er and FCY1were inserted into shuttle plasmids and cotrans-fected HEK293cells with rescue plasmid pBHGlox（delta）E1，3Cre.RESULTS Recombinant adenoviruses with FCY1driven by three or six copies of hypoxia responsive elements-modified hTERT core promoter were constructed and ampli-fied.The titers of the resulting adenoviruses were8.4×1010 pfu#12539L-1 and6.9×1010 pfu#12539L-1 ，respectively，as deter-mined by end-point dilution assay.CONCLUSION The ade-noviral vector construction kit based on Cre recombinase/loxP system can be easily and efficiently used in construction of replication-defective adenovirus. 　　0 引言 　　转录靶向已成为肿瘤基因治疗的热点［1，2］ .使用肿瘤特异性启动子或组织特异性启动子引导治疗基因在肿瘤组织中特异性的表达不仅能有效治疗肿瘤，而且可以在最大程度上减轻基因治疗的毒副作用.目前研究证实，85%以上的人类肿瘤组织中均有端粒酶活性的上调，提示存在端粒酶逆转录酶启动子（hu-man telomerase reverse transcriptase，hTERT）的激活.已有使用该启动子对膀胱癌［3］ 、肝细胞肝癌［3］ 、骨肉瘤［4］ 、胶质瘤［5］ 等恶性肿瘤进行靶向转录基因治疗的报道.为了进一步提高该启动子在骨肉瘤组织中的表达特异性并增强其活性，根据实体瘤组织局部的缺氧微环境特点以及缺氧反应元件可使异源启动子获得在缺氧环境下可被激活的特性［6-9］ ，我们使用Cre重组酶/loxP腺病毒构建系统成功构建了使用缺氧反应元件串联重复序列修饰的hTERT启动子引导酵母胞嘧啶脱氨酶基因FCY1表达的重组腺病毒，为其在实体瘤治疗中的应用奠定了基础. 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 HEK293细胞系和AdMax Kit D购自Microbix Biosystems Inc.（C