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滋补脾阴方药含药血清对内质网应激神经元损伤的保护作用及机制研究_医学论文 滋补脾阴方药含药血清对内质网应激神经元损伤的保护作用及机制研究_医学论文 作者：战丽彬, 钟军华, 路小光, 隋华, 韦巍 【关键词】 内质网 衣霉素 葡萄糖调节蛋白78 凋亡促进因子CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白 小鼠 　　内质网（endoplasmic reticulum, ER）广泛存在于真核细胞中，是蛋白质合成、折叠、运输以及细胞内钙离子储存的主要场所。内质网中钙离子紊乱和未折叠蛋白质蓄积可引发内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ERS），发生具有保护作用的未折叠蛋白反应（unfolded protein response, UPR）。内质网应激直接影响应激细胞的转归，如修复、损伤或凋亡。神经系统许多疾病与内质网应激相关。最近的研究表明，内质网应激介导的凋亡信号传导途径可能与阿尔茨海默病（Alzheimer disease, AD）的发病有关。本研究观察滋补脾阴方药（Zibu Piyin Recipe, ZBPYR）含药血清对由N糖链抑制剂衣霉素（tunicamycin, Tm）引起的内质网应激的影响，以探讨其神经保护机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验药物 滋补脾阴方药由清代吴澄《不居集》中资成汤加味而成，由红参30 g，山药15 g，茯苓15 g，白芍15 g，丹参12 g，白扁豆15 g，莲肉20 g，石菖蒲10 g，远志10 g，檀香4.5 g，橘红9 g，甘草9 g组成，均购自大连医药集团药材公司。中药常规水煎，每毫升中药液含生药3.29 g，4 ℃保存备用。 　　1.2 主要试剂和仪器 达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbeccos modified eagles medium, DMEM)和胎牛血清，Gibco公司产品；胰蛋白酶和TRIReagent，Sigma公司产品；Tm，星形孢菌素（staurosporine, STS），日本Wako公司产品；细胞毒性检测试剂盒，Roche公司产品；RNase OUT和Oligo (dt)，Invitrogen公司产品。二氧化碳恒温培养箱，Thermo Forma公司产品；台式高速冷冻离心机，Sigma公司产品；UV754紫外分光光度计，上海分析仪器总厂产品；温度梯度PCR扩增仪，Thermo Hybaid公司产品；酶标仪，美国BIO公司产品；凝胶成像分析系统，UVP公司产品。 　　1.3 中药血清制备 取健康雄性SD大鼠（220～250 ｇ）12只，随机分为对照组和ZBPYR组，每组6只。适应饲养3 d后，ZBPYR组给予滋补脾阴方药灌胃，10 ml/kg体质量，此剂量灌胃2次/d，连续3 d；对照组给予等体积生理盐水灌胃。于末次给药后1 h腹主动脉取血，静置2 h，2 000 r/min，4 ℃离心15 min分离血清，离心半径为16.1 cm，56 ℃，30 min灭活。0.22 μm滤膜过滤除菌，－20℃保存备用。 　　1.4 Neuro2a细胞的培养 小鼠神经瘤母细胞Neuro2a细胞株由日本北海道大学药学部野村靖幸教授惠赠。细胞常规复苏后加入培养液于5% CO2、37 ℃培养箱培养。细胞单层长满后用终浓度为0.25%胰蛋白酶37 ℃条件下消化3 min，以1∶3传代。培养液含90% DMEM、10%胎牛血清和1％双抗。细胞长至第三代可以使用。 　　1.5 乳酸脱氢酶释放试验 Neuro2a细胞接种后分为对照组、10％空白血清组、5％ZBPYR组、10％ZBPYR组、15％ZBPYR组、Tm（5 μg/ml）组、10％空白血清＋Tm（5 μg/ml）组、5％ ZBPYR＋Tm（5 μg/ml）组、10％ ZBPYR＋Tm（5 μg/ml）组、15％ ZBPYR＋Tm（5 μg/ml）组。细胞单层长至70％时按以上分组给予相应刺激。刺激后细胞放入5％CO2、37℃培养箱继续培养48 h后用乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）释放试验检测LDH泄漏率。LDH实验步骤按试剂盒说明执行。LDH泄漏率为细胞上清中LDH活性与细胞总的LDH活性比值。LDH活性测定用酶标仪于490 nm处检测。另外Neuro2a细胞接种后分为对照组、STS（0.1 μmol/L）组、10％空白血清＋STS（0.1 μmol/L）组、15％ ZBPYR＋STS（0.1 μmol/L）组，待细胞单层长至70％时按以上分组给予相应刺激。刺激后细胞放入5％ CO2、37 ℃培养箱继续培养48 h后检测LDH泄漏率。 　　1.6 逆转录聚合酶链式反应 实验分组同前。细胞单层长至90％时按以上分组给予相应刺激。细胞放入5％ CO2、37 ℃培养箱继续