痛必定注射液对慢性结扎损伤模型大鼠脊髓背角c-fos和P物质的影响_药学论文.docVIP

痛必定注射液对慢性结扎损伤模型大鼠脊髓背角c-fos和P物质的影响_药学论文 痛必定注射液对慢性结扎损伤模型大鼠脊髓背角c-fos和P物质的影响_药学论文 【摘要】 目的痛必定注射液是具有良好镇痛效果的中成药，拟通过本实验研究了其镇痛机理。方法采用免疫组化的方法，研究痛必定注射液对CCI（慢性结扎损伤）模型大鼠脊髓背角c-fos基因表达和P物质含量的影响。结果痛必定注射液能明显降低CCI大鼠脊髓背角c-fos基因和P物质含量。结论该实验证实了痛必定注射液对CCI大鼠具有很好的镇痛作用，减少脊髓背角神经元对传入的伤害性刺激的反应,可能是其发挥镇痛作用的途径之一。 【关键词】 痛必定注射液 c-fos P物质 免疫组化 痛必定注射液是由4种中药（有效成分或部位）组成的具有良好镇痛作用的中成药。其动物实验和临床应用均显示和度冷丁［1，2］有相似的镇痛效果，但无明显成瘾性。其镇痛作用产生的机理尚未完全清楚，且近年来研究表明，外周伤害性刺激等因素可激活脊髓内即刻早期基因c-fos并表达fos蛋白［3～6］；P物质(substance P ,SP)被认为是脊髓伤害性信息传递物质［7］,在脊髓痛觉信息传递过程中发挥着重要的作用［8］，二者是疼痛在分子水平的标志。本实验运用免疫组化方法研究了痛必定注射液对CCI（chronic constriction injur，慢性结扎损伤）模型大鼠脊髓背角浅层c-fos基因表达和SP含量的影响，初步探讨痛必定注射液的镇痛机理。 　　1 材料 　　1.1 动物成年Wistar大鼠，雌雄各半，体重（200±20） g，由吉林大学实验动物中心提供。 　　1.2 主要试剂痛必定注射液40 mg/支，加入生理盐水2 ml，即成为浓度20 mg/ml溶液。按20 mg/kg体重剂量腹腔注射。兔抗大鼠c-fos多克隆抗体(Santa CruzBiotechnology Inc. USA ,北京中山技术有限公司分装)，SP免疫组化染色试剂盒为武汉博士德生物技术有限公司产品，DAB染色试剂盒为北京中山技术有限公司产品，曲拉通X-100(Triton-100)为北京中山生物技术有限公司产品。 　　2 方法 　　2.1 分组、用药、造模Wistar大鼠30只，随机分成A（正常组）、B（CCI造模组）、C（CCI+痛必定）3组。将B组和C组大鼠在无菌条件下1%异戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉，暴露左侧的坐骨神经干，在中部4～5 mm范围内，用4-0号铬制羊肠线打3～4个结，以引起小腿微微抽动为宜，然后逐层缝合。另一侧行假手术。14 d后用特制大鼠固定笼固定大鼠，SH—XYT型小型动物压痛仪（深圳凯强利股份有限公司），分别测量双侧后肢的痛阈值，左侧痛阈显著降低，并结合行为学改变，认为造模成功。C组按20 mg/kg体重剂量连续5 d腹腔注射痛必定注射液，B组同时给予同剂量生理盐水。 　　2.2 取材、切片1%异戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，仰卧固定，快速开胸，暴露心脏，经左心室插管至升主动脉，剪开右心耳，进行心脏灌注。先以无菌生理盐水100 ml快速冲去血液，至流出的液体变清亮，随后用4℃含40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)先快后慢灌流固定约30 min。打开脊柱，取脊髓L3～L5节段置于4℃含40 g/L多聚甲醛PBS中后固定4 h , 再移入4℃含300 g/L蔗糖的0.1 mol/L PBS(pH7.4)中直至组织沉底。冰冻切片机-20℃冠状连续切片，片厚5 μm。选取结构完整者贴于APES处理过的玻片上。 　　2.3 免疫组织化学反应 　　2.3.1 c-fos免疫组化反应采用SP法。切片入0.01 mol/L PBS(pH 7.4)漂洗3 次，5 min/次；3%过氧化氢室温孵育30 min，以消除内源性过氧化物酶的影响，PBS漂洗3次，5 min/次；0.3% Triton-100室温孵育30 min，PBS漂洗3次，5 min/次；正常羊血清封闭，室温孵育60 min，吸去封闭剂，不洗；1∶80 c-fos一抗(0.01 mol/ L PBS稀释)中4℃孵育过夜，室温复温30 min后，PBS漂洗3次，每次5 min；生物素标记二抗(羊抗兔血清)室温孵育60 min，PBS漂洗3次，5 min/次；辣根酶标记链酶卵白素，室温孵育40min，PBS漂洗3次，5 min/次；DAB显色，显微镜下控制显色时间，自来水充分冲洗，室温下避光干燥，常规酒精梯度脱水，二甲苯透明,中性树胶封片。 　　2.3.2 SP免疫组化反应采用SABC法。切片入0.01 mol/L PBS(pH 7.4)漂洗3 次，5 min/次；30%H2O2 1份加纯甲醇50份混合，室温