盐酸胍对人胎盘碱性磷酸酶变性与复性的影响_医学论文.docVIP

盐酸胍对人胎盘碱性磷酸酶变性与复性的影响_医学论文 盐酸胍对人胎盘碱性磷酸酶变性与复性的影响_医学论文 作者：曾艳霞 葛银林 李馨 耿芳宋【关键词】 盐酸 ［摘要］ 目的 观测人胎盘碱性磷酸酶（HPAP）在盐酸胍变性和复性过程中构象与活力的变化，探讨其折叠机制。方法 应用荧光光度法检测HPAP构象变化,用分光光度法检测其活力的变化。结果 低浓度的盐酸胍(lt0.5 mol/L)使酶的荧光强度略有下降，最大发射波长不变，仍为340 nm，酶活力增强；随盐酸胍浓度的增加，其荧光强度升高，最大发射波长明显红移，酶活力迅速下降；当盐酸胍浓度增至3.0 mol/L时，最大发射波长停止于365 nm，酶活力丧失，但其荧光强度在胍浓度增至5.0 mol/L时才停止变化。结论 HPAP在变性过程中存在三态；变性中间态酶可完全复性，而变性态酶仅部分复性，且与复性条件有关。 ［关键词］ 碱性磷酸酶盐酸胍复性变性 ［ABSTRACT］ObjectiveTo examine the changes of conformation and activity of human placental alkaline phosphatase (HPAP) in denaturation and renaturation of guanidine chloride，and to study its folding mechanism.MethodsSpectrofluorimetry and spectrophotometry was used to determine the changes of conformation and activity of HPAP, respectively.ResultsThe fluorescence emission intensity of low concentration guanidine chloride (lower than 0.5 mol/L) decreased a little, without any red shift of emission maximum, and the wave length remained 340 nm, accompanied by a marked increase of HPAP activity. With the increase of guanidine concentration, fluorescence emission intensity increased, emission maximum shifted red and the enzyme was rapidly inactivated. At 3.0 mol/L, emission maximum was redshifted from 340 nm to 365 nm and the enzyme was completely inactivated. Fluorescence emission intensity stopped to increase at 5.0 mol/L.ConclusionA threestate unfolding mechanism is involved in the denaturation process. The intermediated state HPAP is completely refolding. The denaturated state HPAP is partially refolding and its refolding rate is related to refolding conditions. ［KEY WORDS］alkaline phosphatase；guanidine chloride；renaturation；denaturation 研究生物大分子的结构与功能是分子生物学的一个核心问题。对酶分子而言，其构象的完整对表现其活力是至关重要的。研究变性与复性过程中酶构象改变与活力变化的关系，是阐明酶的结构与功能、酶学性质及作用机制的有效方法；也可用这种方法研究肽链的折叠，即酶的复性过程，探讨酶的折叠机制。人胎盘碱性磷酸酶（HPAP）是通过寡糖磷脂酰肌醇锚在晚期胎盘细胞膜上的一种含巯基的金属糖蛋白，有显著的耐热性和化学稳定性，其溶解形式为二聚体，亚基相对分子质量为64 000，一级结构已基本确定［1,2］，其原级同工酶至少有4种类型，即小肠型、肝型、生殖细胞型及晚期胎盘型，它们分别由4个不同的基因位点所控制［3］。由于HPAP是一种新进化的基因产物，又是某些肿瘤的标志酶之一，故已对其进行了广泛的研究，但