盘状结构域受体2与EGFP融合载体的构建及细胞中的活性分析_医学论文.docVIP

盘状结构域受体2与EGFP融合载体的构建及细胞中的活性分析_医学论文 盘状结构域受体2与EGFP融合载体的构建及细胞中的活性分析_医学论文 作者：于江天，苏金，任婷婷，刘新平 【关键词】 盘状结构域受体2；融合载体；EGFP；磷酰化 【Abstract】 AIM: To find a way of detecting the ectopic expression of discoidin domain receptor 2(DDR2) in the cell and of tracing dynamically the expression distribution of DDR2 protein. METHODS: The fusion construct of DDR2 with EGFP was obtained by PCR amplication and restriction enzyme digestion, and transfected into 293T cells. The expression of the green fluorescence protein was examined by inverted microscope and the expression and activation of this fusion protein was confirmed by Western blot. RESULTS: DDR2/EGFP fusion plasmid was successfully constructed. Further analysis also demonstrated that the fusion protein has similar expression and activation pattern with wild type ones. CONCLUSION: The success in constructing the fusion plasmid DDR2/EGFP and in detecting its phosphorylation can lay a foundation of studying the function of DDR2. 【Keywords】 discoidin domain receptor 2, fusion vector, EGFP, phosphorylation 【摘要】 目的： 寻找使盘状结构域受体2（DDR2）在细胞内的表达情况易于检测并能动态追踪其蛋白表达分布的途径. 方法： 采用PCR技术扩增获得DDR2编码区无终止码序列，通过限制性酶切将DDR2片段亚克隆入pEGFPN3载体中，转染293T细胞后通过倒置显微镜观察绿色荧光蛋白的表达，并用免疫印迹技术检测融合载体的表达及胶原刺激后活化状况. 结果： 成功构建了DDR2/EGFP融合表达载体，进一步的分析也证明此融合表达载体能在细胞中正确表达并可以被配体所激活. 结论： DDR2/EGFP的成功构建及可进一步检测磷酸化，为深入研究DDR2的功能奠定了基础. 【关键词】 盘状结构域受体2；融合载体；EGFP；磷酰化 盘状结构域受体2(Discoidin Domain Receptor 2, DDR2)属于一种受体型蛋白酪氨酸激酶，可被天然纤维型胶原活化［1-2］，从而介导基质金属蛋白酶(MMP1,2和13)的表达［2-4］. 本实验室的前期研究［5-7］发现，DDR2在类风湿性关节炎(RA)成纤维样滑膜细胞中呈高表达状态，并具有较高的磷酸化水平. 为了深入研究DDR2介导的信号转导过程，我们旨在克隆其cDNA序列并将其以易于检测的形式进行表达. 1材料和方法 1.1材料大肠杆菌DH5α菌种和293T细胞为本室保存；引物由赛百盛公司合成；克隆载体pMD18T, Taq酶, dNTPs, dATP, 各种限制性内切酶及T4连接酶（TaKaRa公司）；DMEM培养基和新生小牛血清（Gibico公司）；pEGFPN3表达载体和抗EGFP抗体（Clontech公司）；抗酪氨酸磷酸化抗体4G10（Upstate公司）；DNA提取及回收试剂盒（天为公司）；PCR模板为本室构建的pMD18TDDR2 Lipofectamine 2000（Invitrogen公司） Westernblot所用发光底物（Pierce公司） Olympus IX71荧光倒置像差显微镜. 1.2方法 1.2.1引物设计将DDR2全长无终止码序列命名为WSFDDR2（Without Stopcode Full length DDR2），根据GenBank中人DDR2分子序列（编号NM_006