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上海市科技兴农重点攻关项目 课题可行性报告 课 题 名 称 饲料抗菌肽GAL-6的研制填 报 说 明立的依据和目的意义一、国内外的研究现状 抗菌肽是广泛存在于动植物体内的一类内源性抗微生物多肽，富含精氨酸，分子结构稳定，生物活性多样，是生物体天然免疫的重要组成成分。20世纪80年代中期，美国加里福尼亚大学Ganz等在研究吞噬细胞非依赖氧杀菌机制过程中，从兔和人中性粒细胞胞浆颗粒中发现一组一级结构相似的小于100个氨基酸的小分子阳离子肽，由于其广谱的抗微生物活性被为“防御素(defensins)”虽然它们结构相异，但大多数为阳离子多肽。由于微生物细胞表面多呈阴性，因此抗菌肽易与细胞膜的磷脂结合，破坏细胞膜,导致胞质外流,从而杀伤微生物。抗菌肽对于革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、螺旋体、分枝杆菌、真菌和一些被膜病毒均表现抗性, 具有广谱抗菌性,甚至对癌变细胞也有抑制作用。抗菌肽分子以二硫键相互稳定，以此来增加其抵抗溶菌酶以及变性的能力。 根据抗菌肽氨基酸组成、半胱氨酸位置及分子内二硫键连接方式不同可分为α-抗菌肽、β-抗菌肽、θ-抗菌肽和植物抗菌肽、昆虫抗菌肽等。 1994年首次发现鸡体内存在抗菌肽，目前认为它们均属于β-抗菌肽。鸡β-抗菌肽称为Gallinacin。作为鸡的重要天然免疫屏障，Gallinacin在鸡的肝脏、气管、肺脏、肾脏、血管、脑、胸腺、法氏囊、皮肤、骨髓等器官和组织广泛分布。在鸡的异嗜性细胞中现已纯化出14种抗菌肽多肽，包括Gal-1、Gal-1α、Gal-2、Gal-3、Gal1-Gal13、Gal-5、Gal-6、Gal-7、Gal-8、Gal-9、Gal-10、Gal-11、Gal-12、Gal-13，其中Gal-7、Gal-8、Gal-9、Gal-10、Gal-11、Gal-12、Gal-13是2004年8月Xiao等用生物信息学的技术以原位方式证明了其地存在。Gal-1、Gal-2、Gal-4、Gal-5、Gal-6、Gal-7和Gal-10的分布广泛，几乎所有的鸡品种所有的检测组织都有表达；Gal-3、Gal-8、Gal-9、Gal-11、Gal-12和Gal-13的分布有组织特异性，但品种间和个体间的差异小。对H9N2病毒诱导鸡β-抗菌肽基因在体内的表达研究表明[5]：感染H9N2 AIV病毒后，广西黄鸡Gal-4在法氏囊组织中的表达受到诱导，而其它β-抗菌肽基因的表达受H9N2病毒感染的影响不大；感染H9N2病毒后，竹丝鸡的多个组织的抗菌肽基因表达受到抑制，包括Gal-5基因在十二指肠中的表达，Gal-6基因在喉气管组织的表达，Gal-7在喉气管和十二指肠的表达，而Gal-8在法氏囊组织中的表达受诱导；感染H9N2病毒后，清远麻鸡Gal-4基因在十二指肠中的表达、Gal-5、Gal-7基因在肝脏组织中的表达受到诱导，而Gal-5基因在肾脏组织中的表达、Gal-7基因在喉气管组织中的表达和Gal-10基因在肺脏的表达受到病毒感染的抑制；杏花鸡的Gal-5基因在十二指肠中的表达、Gal-7基因在肝脏组织的表达受到H9N2病毒感染的诱导，而Gal-7基因在十二指肠中的表达受到抑制；胡须鸡在感染H9N2病毒后，Gal-3基因在喉气管组织的表达、Gal-4基因在喉气管组织中的表达、以及Gal-5基因在肝脏组织中的表达受到诱导，而没有抗菌肽基因的表达受抑制。 目前鸡β-抗菌肽制备获取的主要方法有：1）机体自身合成法，利用生物分离纯化技术将家禽体内自身合成的抗菌肽提取分离纯化，存在的问题是获得的数量较少，不能满足需要；2）化学合成法：利用化学方法合成具有活性的抗菌肽，但该法成本极高，不易进行规模化生产；3）基因工程法：将编码抗菌肽的基因克隆于培养条件相对简单的微生物细胞内，构建基因工程菌株，将抗菌肽的生物合成与现代发酵技术有效整合，利用基因工程菌株的高密度发酵技术，结合现代分离技术，将具有生物活性的抗菌肽分离纯化。这是目前较为有效且成本相对较低的方法。抗菌肽编码基因的研究，表达系统的成熟为利用基因工程技术高效表达制备鸡抗菌肽多肽提供了可能； 1. 鸡β-抗菌肽基因的表达与克隆进展 β-抗菌肽基因的表达有两种方式，组成性表达和诱导表达。β-抗菌肽表达具有组织特异性和种间变化差异的特点，同时还受生长发育的调控。对于β-抗菌肽基因研究，有些结果不一致，表明β-抗菌肽基因的复杂性，有望通过进一步加强分子水平的调空机制研究，为基因工程大量表达β-抗菌肽创造条件。Β-抗菌肽表达时转录调控受到多种因子的作用，其中一些转录因子的激活可能和细胞分化时细胞生理生化的改变有关。Gal1-3可以被LPS、灭活卡介苗诱导表达，分布也较广泛。Gal-1，Gal-2不被LPS、灭活卡介苗诱导表达。至于火鸡β-抗菌肽是否与