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细胞生物反应器大规模培养 草鱼细胞和病毒’ 叶雪平杨广智罗毅志 (浙江省淡水水产研究所,湖州31300力 陈因良陈志宏 (华东化工学院生化工程研究所,_仁海2。。237) 提要应用细胞牛物反应器微载体悬浮培养法,对草鱼胚胎细胞CP一80进行大规模 培养,}r.J对增殖草鱼出血病病毒。细胞经培养6天后,细胞量可达到8,斗、IOc叶11。了。飞,较始 接量(2,105,n。了斌)提高了封倍。接入草鱼出血病病毒后,经5天培养增殖,谬力达到 8.01上gTCID:。/o.ltnl,较始接毒力(3.邓LgTCIL)、。‘o.lml)增加了魂.25个对数值。 关键词细胞生物反应器,微载休悬浮培养,草鱼细胞,草鱼出血病病毒 VanWe,e1(1967)首先报道了应用DeaeSoph掀。二八一5。作微载体进行功物贴壁细 胞(““cho跳gedepe耐。ntcel愧)的培养,使细胞产量获得了成倍提高。至今已有近百种动 物细胞在各种微载体_L进行培养。近十年来建立起来的细胞生物反应器培养工艺,由于 优化了细胞生长条件,使一单位培养液的细胞产量较之一般的静培养,提高了几倍甚至几十 倍。现在微载体悬浮培养细胞技术正广泛应用于人医和兽医的疫苗、干扰素.单克隆抗 体、激素、酶等细胞生物产品的研究和生产。 B二。eL.Ni。h川。on(198娜应用微载体培养技术,培养5种鱼类细胞并进行传染性 胰脏坏死病病毒(I护NV)的增殖。在静置培养条件下CllSE等等细胞产量可达到2.gx 1沪colls/ml,接入I卫NV后病毒毒力比静置单层培养提高了2倍。CHARLESBUCK 和(,‘T,r工心h(1985)报道了用looml转瓶(。pinoei·bottle)进行了BB、Rr1’体2等6种鱼 细胞的培养,ls]时增殖CCV病毒,细胞和病毒产量均有明显提高。但迄今为止,应用细 胞生物反应器进行鱼类细胞和病毒的大规模培养,国内外尚未见报道。我们应用GT一2 微载休,将草鱼胚胎细胞和出血病病毒在细胞生物反应器中进行悬浮培养,取得了高效增 殖的效果。 材料与方法 (一)材料1.细胞草鱼吻端组织细胞zC一7901和草鱼胚胎细胞CP名o均由浙江淡水水产研究所建株。 2.徽载体GT召微载体由华东化工学院生物工程研究所细胞培养技术实验室提供。 3,病毒zV名909草鱼出血病病毒株由浙江淡水水产研究所建立和保存。 4.培养罄采用199培养基(日本).用前加小牛血清和双抗,并用NaHCO:调节p月为7甲。~ 7,2 5.细胞生物反应器采用1.5升的Coll垮enT陇细胞培养系统(美国NBS公司出品)。 (二)培养方法 1.细胞的悬浮培养将种子细胞消化分散后与经过处理的微载体混合,混合后作静态吸附,间歇 摇晃混合物,使细胞贴壁尽量均匀。之后,将混合物加入到培养罐中,同时加入培养液达到最终培养体 积(1200耐),开动搅拌系统使微载体悬浮在培养液中。 2甲细胞观察和计数在悬浮培养过程中,每隔触小时取样观察细胞生长情况,同时取样1.oTnl, 用。.02万ED了.A消化后,在血球计数板上进行细胞计数。 3,病毒的接种与收获当细胞在微载体表面长满后,换入含草鱼出血病病毒的新鲜无血清培养 液,继续悬浮培养.每隔24小时取样观察细胞病变情况,待细胞病变完成时,收集细胞病毒培养物,里 一3O.C保存。以细胞病变法(TC工D‘口)和鱼体感染法(LD。.)测定毒力。 结果 CP一8钓-..seZC一790]—入一 60叨20(笔并创版理黑 02468时lb]〔小时) 图1CP泛泊和zc万901细胞在GT召微载 体上的贴壁率(微载体3.OIngZInl;接种细胞 量3.1、10‘。ell吕/Inl) rig.1Rate试CP毛oa血ZC一洲1oell。 at七aob卫leu七七0GT一ml。欺arrior(Mloro- earriereo训e助珊lion二3甲orng/姐l;I工loeula- tiondensity:3.lxlo,cells厂ml) (一)细胞在微载体上的贴壁 用3mg/ml的微载体分别与3.lx 10协eell。/ml的ZC一7901和CR80细胞 混合于200ml的玻璃瓶中,培养液的体 积为10oml,静置于25~26OC下进行吸 附,每隔l小时摇动培养砌手计数培养 液中的细胞量,按细胞贴壁率二(1一培 养液中的游离细胞数/细胞接种数)x 100多的公式计算细胞的贴壁率。图1为 两种细胞在微载体上的贴壁变化。20-- 7901细胞的贴壁率较CP--80细胞略低, 但两者相差不多。随着时间的延长,贴壁细胞逐渐增多,6小时后均达到70环以上。24小 时后观察,培养液中仍有少量游离细胞。 (二)细胞在微载体上的生长 按前述方法,将微载体与CP一80细胞混合并在1.5升的细胞生物反应器