菊花叶片培养实验方案.docVIP

实验：菊花叶片愈伤组织诱导及其分化 一、实验目的 1、以无性繁殖直接获得大量优良菊花后代植株而不会发生性状分离。 2、学习外植体消毒的步骤和要求、熟练掌握无菌操作技术，对植物的再生体系有进一步了解。 3、研究不同激素的不同浓度对菊花愈伤组织诱导的影响。 二、实验原理 利用细胞分化的全能性，任何单细胞拥有与母本相同的遗传组成，来发育成与母本相同形状的潜能，利用菊花的叶片为外植体，利用含有激素的MS培养基上诱导愈伤组织，进而分化成苗。 本实验采用菊花叶片，同时具有采取方便，易于操作等优点。 三、实验材料 1、材料：菊花叶片50片 2、试剂：蔗糖150g（愈伤组织诱导60g,芽分化60g,生根30g）、琼脂35g(愈伤组织诱导14g，芽分化14g,生根7g)、活性炭3g、1mol/HCL、1mol/NaOH、6-BA 0.1mg/L、NAA 0.1mg/l、2,4-D 0.1mg/L、75%酒精1瓶、无菌水10瓶、0.1%HgCl溶液。 3、用具及仪器设备：接种瓶100个、接种盘若干、电磁炉1个、玻璃棒6根、高压灭菌锅、超净工作台、打火机、器械灭菌器、酒精灯、2000ml废液缸1个、500ml无菌烧杯1个、1000ml量筒一个、镊子两把、口罩、MS及各种母液等。 四、实验步骤 1、愈伤组织诱导 配置培养基 愈伤组织诱导培养基：MS+2，4-D+蔗糖30g/L+琼脂7g/L MS+NAA+蔗糖30g/L+琼脂7g/L 其中2,4-D与NAA的浓度如表1所示： 2,4-D NAA 浓度 0.5 1 2 0.5 1 2 其中以MS作为基本培养基，分别加入NAA，2,4-D的不同浓度，每个浓度各做300ml培养基。 培养基具体配置方法： 培养基灭菌[121℃，20min] 灭菌后1-2天在接种，看培养基灭菌是否完整。 外植体处理 选取无病虫害的幼嫩新鲜叶片用洗涤液洗净，再用清水反复清洗，再在流动的自来水下冲洗30min后立即转入超净工作台上，接种人员进入接种室前要先用肥皂洗干净双手至肘部。先用75%酒精对外植体浸泡消毒20-30秒，再在无菌水里清洗2-3次，再倒入0.1%升汞灭菌5min,后倒掉升汞用无菌水清洗5-6次，在用无菌水浸泡即可。 注意：在灭菌及清洗过程中要用镊子不断搅拌，每次清洗要彻底，以及在接种时要避免因时间过久而导致外植体损伤。 接种室的灭菌与超净工作台的预热过程 接种 将所取叶片切成0.5x0.5cm小块，迅速接种于培养基上，叶片切口要接触培养基，从而有利于叶片诱导。 本组6人，每人负责一个浓度，每个浓度做6个平行，每个接种瓶接种5个菊花叶片组织。 培养 接种好后贴上标签纸，其中一半放入暗处、25±2℃下培养，一半放入1000lx-2000lx光下、25±2℃下培养。 2、芽分化 配置培养基 芽分化培养基:MS+NAA 0.5mg/L+6-BA 2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L 培养基灭菌[121℃，20min] 灭菌后放置1-2天，看培养基是否灭菌完全。 转接 待愈伤组织诱导结束时，每人负责自己的浓度转接，将愈伤组织切成0.3cm的小块接种于芽分化培养基上，转移到培养室培养，直到愈伤组织上出现嫩绿色、水浸状芽点，表明芽分化成功，再经过一段时间分化即可。 3.生根 培养基的配置 MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.2mg/L+0.3%活性炭+琼脂7g/L 培养基灭菌（121℃，20min）生根 待芽分化成功后，每人负责自己浓度的转接，将芽分化成功的菊花苗转接到生根培养基上，转入培养室培养。 五、实验结果 2,4-D（mg/L） 4