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黑龙江生物科技职业学院 生物分离技术实训指导书 二００五年三月 目 录 1、综合实训一：L-胱氨基酸的制备………………………………………1 2、综合实训二：树脂柱纯化法制备谷光甘肽 …………………………3 3、综合实训三：锌盐沉析法提取胰岛素…………………………………6 4、综合实训四：DNA制备……………………………………………………9 5、综合实训五：菠萝蛋白酶的制备………………………………………12 6、综合实训六：卵磷脂的制备及鉴定 …………………………………15 7、综合实训七：银耳多糖制备及鉴定和含量测定……………………17 综合实训一 L-胱氨基酸的制备（4学时） 一、目的要求 1.学习胱氨酸的提取分离原理和方法。 2.学会吸附分离技术的原理。 二、实验原理 胱氨酸是由两个β-巯基-α-氨基丙氨酸组成的含硫氨基酸。胱氨酸呈六角形片状白色洁净或洁净粉末，无味，微溶于水，不溶于乙醇及其他有机溶剂，易溶于稀酸和碱液中。在热碱液中易分解。胱氨酸的等电点（pI）为4.6，熔点为260～261℃。胱氨酸比半胱氨酸稳定，在体内转变成半胱氨酸后参与蛋白质合成和各种代谢过程，又促进毛发生长和防止皮肤老化等作用。 胱氨酸存在于人发、猪毛、羊毛、马茂、羽毛及动物角等的蛋白质中，其中人发含量最高，达17.6%。胱氨酸是氨基酸中最难溶于水的一种，因此可利用这种特性，通过酸水解，从废杂猪毛、人发、鸡毛、羊毛等角蛋白中，分离提取胱氨酸。 三、材料用具 （一）材料 废杂毛。（人发或猪毛） （二）试剂 盐酸、氢氧化钠、乙酸、乙酸钠、氨水、硫酸铜、硝酸、硝酸银、硫化氢、硫氰酸铵、亚硫酸钠、碘化钾、活性炭、骨炭粉、硫酸甲醛溶液、溴液。 （三）器具 玻璃钢水解罐、耐酸锅、搪瓷缸、不锈钢桶、搪瓷桶、离心机、玻璃布、白纱布、温度计、酸度剂、布氏漏斗、3号垂熔漏斗、2号砂心漏斗、恒温水浴、碘量瓶、滴管、试管、移液管、量筒、烧杯、pH试纸、酸度剂。 四、实验方法 （一）流程 见图1 （二）操作 1.清洗 用60℃左右的热水，加少量洗涤剂，搅拌洗涤4～6min，洗去吸附在毛发上的油脂，然后捞出，再用清水冲洗干净，滤干，放在通风处晒干或烘干备用。 2.水解 按毛发的量，量取2倍30%工业盐酸，加入到玻璃钢或搪瓷水解罐中，通蒸汽加热到70～80℃，立即投入清洗晒干的毛发，继续加热，间歇搅拌，使温度均匀，升温到100℃开始记温，每隔0.5h记温一次，在1～1.5h内升温至110℃左右（即罐温），以后继续维持罐压14.6kPa，水解13h左右，水解期间要有回流装置，保证水解酸度，使水解完全，水解时间可从水解罐内溶液温度达100℃时计算。 水解完全后，停止回流，立即趁热过滤，先用玻璃布抽滤除去大的黑腐质，然后再用双层纱布抽滤，将滤液移到中和锅内，滤液用1：10盐酸冲洗2～3次，准备中和。 3.中和 将过滤好的滤液趁热在搅拌下加入浓度为30%～40%的氢氧化钠溶液，当中和到pH达4.0时，停止加碱液，然后改用乙酸钠饱和溶液中和到pH为4.8左右，停止搅拌，静止10～12h。用涤纶布过滤沉淀物，甩干或吊干，即得粗品。中和时温度应保持在50℃左右，而且要在0.5h内完成。 4.提纯 称取适量的胱氨酸粗品，加入粗品量13%～14%的工业盐酸，搅拌30min左右，等粗品全部溶解后，在加入糖用活性炭，加热到90～98℃，在此温度下恒温搅拌2～3h，然后过滤脱色液，滤液加热到80～85℃，在搅拌下加入30%氢氧化钠溶液，调节pH至4.8时，静置。使结晶沉淀完全。 5.精致、干燥 称取适量胱氨酸提纯后的粗品，加入5倍量的1：12的盐酸，加热到40℃时，加入5%骨炭粉，升温到60℃，保温搅拌1h。然后用布氏漏斗过滤，滤液在经过3号垂熔漏斗过滤，滤液应无色透明。 将溶液移入搪瓷缸中，搅拌下加入10%氨水调节溶液pH至4.8，静置5～6d，即有胱氨酸精品析出，过滤出结晶，用无离子水洗至无氯离子，干燥即得成品。 五、注意事项 1.用硫酸调节pH值时，应用酸度计边测边调。保证其准确性。 2.水解终点的判定，加入10%氢氧化钠溶液2mL，在滴加硫酸铜溶液几滴，摇匀后，如仍有明显的天蓝色表明水解完全。 六、思考题 1.胱氨酸的物化性质是什么，通常提取胱氨酸选用什么原料? 2.提取胱氨酸时应注意什么条件变化？ 综合实训二：树脂柱纯化法制备谷光甘肽（6学时） 一、目的要求 1.了解树脂柱纯化法制备谷光甘肽的基本原理； 2.熟悉树脂柱具体应用技术； 3．掌握多肽类生化物质提取纯化的基本操作技术。 二、实验原理 谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸构成的三肽。自然界中谷胱甘肽主要存在于酵母、谷物种子胚芽，人体和动物的心脏、肝脏、肾、肌肉、血液的红细胞和眼球中。动物组织中含量较高，而植