二甲双胍对乳腺癌细胞活性氧的影响.docVIP

二甲双胍对三阴性乳腺癌细胞活性氧的影响及诱导凋亡的作用 [摘要] 目的: 研究二甲双胍对三阴性乳腺癌细胞活性氧的影响以及其诱导凋亡的作用。方法:使用不同浓度药物联合处理MDA-MB-231细胞，MTT 法检测药物的生长抑制效应； PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡；集落克隆形成实验观察二甲双胍对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖作用的影响；流式细胞仪检测细胞内超氧阴离子含量；MTT法检测二甲双胍联合细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)抑制剂对细胞增殖的影响。 结果: MDA-MB-231细胞经过1.25、2.5、5、10、20mmol/L 二甲双胍作用24、48、72h后，细胞存活率随着药物浓度的增加，作用时间的延长，细胞存活率明显下降；0，5，10，20 mmol/L二甲双胍处理的MDA-Mb-231细胞凋亡率分别为0.1%，2.9%，6.9%，17.7%；集落克隆形成实验结果表明，二甲双胍对MDA-MB-231细胞的增殖有抑制作用。与对照组相比，二甲双胍组细胞内超氧阴离子含量显著增高；二甲双胍联合细胞内活性氧抑制剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC) 组细胞存活率为66.68%，二甲双胍组细胞存活率为44.12%。结论: 二甲双胍对三阴性乳腺癌细胞MDA-Mb-231有增殖抑制及诱导凋亡的作用，其作用可能与细胞活性氧的升高有关。 [关键词] :乳腺肿瘤；二甲双胍；细胞活性氧；凋亡； 二甲双胍（Metformin）是2型糖尿病患者常用口服降糖药。2005年Evans等[1]研究发现二甲双胍可降低糖尿病患者恶性肿瘤的发生率。有研究证实二甲双胍对于多种实体肿瘤均有不同程度的增殖抑制的作用[2-5] ，但对于三阴性乳腺癌细胞（triple negative breast cancer, TNBC）的作用及其相关分子机制尚不明确。本研究通过探索二甲双胍对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞活性氧的影响以及其诱导凋亡的作用，探讨二甲双胍对于三阴性乳腺癌是否具有抑瘤作用，其作用是否与细胞活性氧相关，为开展相关的体内实验研究以及临床研究提供一定的依据。 1 材料与方法 1．1 材料 三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231：购于中科院上海细胞库。DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶（Gibco 公司产品）、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、碘化丙啶(PI)、Triton X-100、二甲双胍（美国Sigma公司），NAC（中杉金桥生物技术），Caspase- 3检测试剂盒（碧云天生物技术所）。恒温二氧化碳培养箱( SHELLLAB 公司， 美国），倒置显微镜( Olympus 公司，日本) ，净化工作台( 上海浦东物理光学仪器厂，上海)，DG3022型酶联免疫检测仪（南京华东电子管厂），流式细胞仪（BD Flow cytometers Reagents），台式离心机(美国Fisher公司)， 1.2 方法 1.2.1细胞培养 人TNBC细胞株MDA-231在高糖型DMEM培养基中培养（含10％的灭活FCS，2.0g/L碳酸氢钠，20mmol/L Hepes，0.6μg/ml胰岛素，100IU/ml青霉素，100μg/ml链霉素），37.0℃、5％CO2、95％空气温湿环境，CO2培养箱培养传代培养，1～2d换液1次。培养TNBC MDA-MB-231细胞株，至第三代时用做实验；实验分为对照组、二甲双胍组和联合用药组。 1.2.2 MTT法检测细胞活性 取对数生长期MDA-231细胞，0.25%胰蛋白酶消化，调细胞数为1×104/ml，96孔板每孔接种细胞悬液200μl，于5% CO2孵箱中孵育，24 h后细胞换液，加入药物，每孔设5个复孔。对照组仅含培养液,二甲双胍组（1.25、2.5、5、10、20mmol/L）。继续孵育24 h 、48 h和72h后，每孔加MTT(5 mg/ml)溶液20μl，继续孵育。4 h后弃培养液，每孔加DMSO 100μl，微量振荡器振摇5 min后，酶标仪检测570 nm波长下每孔的吸光度( A) 值。上述实验重复3 次检测。细胞活性(%)=加药组A/对照组A×100%。 1.2.3 PI 染色流式细胞仪检测细胞凋亡 将对数生长期MDA-231细胞制成单细胞悬液，接种于24 孔板，每孔1×105个细胞，培养24 h 后加入0，5，10，20 mmol/L二甲双胍，继续培养48 h 后，收集各孔培养液到对应流式管中，冷PBS清洗，收集清洗液到对应培养液中，胰蛋白酶消化，收集消化液到对应流式管中，冷 PBS 清洗，收集清洗液到对应流式管中，1200r／min离心，10 min，弃上清，各管加入750μl的PI缓冲液 ( 5 mg PI 0. 1 g 柠檬酸钠 10