一种新型DNA标记技术——限制性位点扩增多态性(RSAP)的建立与优化.pdfVIP

维普资讯 第 34卷 第 9期 西北农林科技大学学报(自然科学版) VoI．34 No．9 2006年 9月 Jour．ofNorthwestSci—TechUniv．ofAgri．andFor．(Nat．Sci．Ed．) Sep．2006 一 种新型DNA标记技术—— 限制性位点扩增 多态性 (RSAP)的建立与优化 杜晓华 。，王得元。，巩振辉 (1西北农林科技大学 园艺学院，陕西 杨凌 7l2100； 2厂东‘省农业科学院 蔬菜研究所 广东省果蔬新技术研究重点实验室 ，广东 广州 510640) [摘 要] 为了避开基于限制性酶切位点分子标记技术的DNA酶切环节，简化其复杂的程序，试验以辣椒为材 料，建立了一种新型DNA标记技术一 限制性位点扩增多态性 (RSAP)，并对其反应体系进行了优化，对 RSAP适 用性、重复性进行了检验 。结果显示，RSAP技术 的引物为2条长度均为 18bp的引物 ，引物的3端为 4～6个碱基的 限制性酶切位点序列，接着是 12～14个碱基的随机序列，2条引物的限制性位点和随机序列不同；PCR扩增的前5个 循环采用 35C的退火温度，随后的35个循环采用 48C的退火温度；在25 I反应体系中，模板DNA用量为2Ong， Mg 浓度为 2．5mmol／I，dNTPs浓度为 0．2mmol／I，7’aqDNA聚合酶用量为 1．5U，2条引物浓度均为 600 nmol／I；RSAP技术重复性好，适用性广泛，是一种操作简便、产率中等、稳定可靠的DNA标记技术。 [关键词] 限制性位点扩增多态性；DNA标记技术；蔬菜育种 [中图分类号] $603．2 [文献标识码] A [文章编号] 1671—9387(2006)09—0045—05 作为一种遗传标记，DNA标记因具有数量多、 序复杂、步骤繁琐等不足，整个过程包括了基因组 多态性高、可直接反映基因组 DNA等优点，已被应 DNA或 cDNA 的酶切 ，寡核苷酸衔接子的连接 ，连 用于生物遗传多样性分析、连锁图谱构建和重要基 接片断的选择性扩增等。其中DNA不完全酶切时， 因的标记等方面 。然而 DNA标记的广泛应用和深 采用甲基化不敏感 的酶会导致检测时带型不一致， 入推广有赖于 DNA标记技术的不断发展与改进。 影响AFIP指纹分析的准确性；采用 甲基化敏感 的 操作简便、多态性丰富、产率中等 、结果稳定可靠和 内切酶，基因组的甲基化又会导致假多态性 出现 ]。 成本低廉 ，已成为分子标记技术的发展方向。基于生 其他一些改良的AFIP技术，虽然不同程度地增加 物基因组上广泛分布的限制性 内切酶识别位点(简 了检出的多态性或简化了步骤 ，但仍离不开限制性 称限制性位点)，BotsteinD等 l【创建了限制性片断 内切酶酶切和随后的复杂步骤[3。]。为了进一步改进 长度多态性 (Restrictionfragmentlengthpolymor— 技术 ，本研究通过设计独特 的引物和 PCR扩增程 phism，RFIP)标记技术 ，该技术通过克隆的杂交探 序 ，建立了一种新型的无需限制性酶切及其他复杂 针来检测限制性位点之间的多态性，具有稳定可靠、 步骤，仅一个简单 PCR即可实现对 DNA 限制性位 共显性等优点，但其 中的Southen杂交耗时费力，使 点多态性进行检测的DNA标记技术，命名为限制 其广泛应用受到一定限制。此后，伴随着 PCR技术 性位点扩增多态性 (Restrictionsiteamplifiedpoly～ 的诞生和方法 的不 断改进，扩增片断长度 多态性 morphism，RSAP)，并以辣椒为试材 ，对该项技术进 (amplifiedfragmentlengthpolymorphism，AFIP)L